猪博卡病毒(Porcine Bocavirus, PBoV),是细小病毒科(Family Parvoviridae)、细小病毒亚科(Subfamily Parvoviridae)、博卡病毒属(Bocavirus Genus)成员之一,最早在2009年,由瑞典科学家,在患有离乳后、多系统衰竭综合症(Post-weaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)的猪淋巴结中发现,之后,世界各国也陆续发现了此种病毒。到现在为止,PBoV感染已在瑞典、中国、美国、加拿大、墨西哥、罗马尼亚、匈牙利、乌干达、韩国、日本等国家均有报道。PBoV是无包膜、二十面体对称、单链DNA病毒。病毒颗粒的直径25-30nm。基因组全长约5000bp,包含3个主要开放读码框架(open reading frames, ORFs), ORF1、ORF2、ORF3。ORF1,位于基因组5’端,编码非结构蛋白NS1。ORF1含有保守序列,与病毒的滚环复制、解旋酶、以及ATP酶活性有关。ORF2,位于基因组3’端,编码两个主要的衣壳蛋白VP1、VP2,参与病毒颗粒的组装,决定抗原性。ORF3编码功能未知的非结构蛋白NP1,研究报道此蛋白是犬微小病毒(Canine minute virus, CMV)复制的必需蛋白。也有报道HBoV的NP1基因,可以阻断干扰素(IFN)的合成,可能参与免疫逃逸。PBoV的分类方法还没有统一,按照VP1基因核苷酸序列的不同,PBoV可分为三个基因组(Groups): PBoV G1、PBoV G2,和PBoV G3。其中PBoV G3又可以分成5个亚基因组(Subgroups)。到目前为止,关于PBoV的致病性的分析研究数据有限,但PMWS患病猪的PBoV的血清阳性率明显高于非PMWS猪群,说明PBoV可能与PMWS相关。另外,PBoV常与猪圆环病毒(Porcine circovirus, PCV)、猪细环病毒(Porcine torque teno virus, PTTV)、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)等共感染,PBoV在淋巴结、血清、肠道等许多组织中被检测到,说明病毒可能会引起其它方面的病变。目前,对单一PBoV的发病机理,还没有明确的证据。在病毒检测方面,目前已经建立了几种不同的PCR和定量PCR的方法,用于检测病毒核酸。同时也可用间接免疫荧光检测法、以及酶联免疫法(Enzyme-linked Immuno Sorbent Assay, ELISA),来检测病毒抗原。但由于缺乏特异性好、敏感性高的抗-PBoV抗体的检测方法,大规模的PBoV流行病学调查尚未能很好的开展。因此,通过基因工程方法表达病毒抗原来检测抗体,对研究病毒的抗原性和免疫原性、进而对于开展PBoV的流行病学调查、乃至病毒疫苗的研制都有重要意义。目前病毒蛋白可以通过细菌、酵母、昆虫细胞、哺乳类动物细胞等多种表达系统来表达。细菌(主要是大肠杆菌)表达系统,有操作简单、产量高的优点,但不能对蛋白进行糖基化修饰；酵母表达系统,其产物与天然分子也还有一定差异；哺乳动物表达系统,虽然产物接近天然蛋白,但产量很低。昆虫细胞表达系统,作为真核细胞(Eukaryocyte)表达系统,表达产量非常高,产物的功能与结构与天然蛋白相近。在昆虫细胞表达系统中,杆状病毒(Baculovirus)表达系统已被广泛应用于类病毒颗粒(Virus-like particles)的合成。其工作原理是：将外源目的基因,通过基因重组(Gene recombination)的方式,整合到多角体病毒(AcNPV)的多角体蛋白基因的启动子下游,然后将重组的杆状病毒(recombinant baculorirus)感染昆虫细胞；当Recombinant baculovirus在昆虫细胞内复制时,外源目的基因,可以利用多角体蛋白强悍的启动子的启动作用,在昆虫细胞中得到大量表达。产生的目的蛋白,具备与天然蛋白质相类似的功能和结构,抗原性也非常接近。特别是在表达无包膜病毒的构造蛋白时,可以在昆虫细胞内,自动装配成类病毒颗粒(VLPs)。这种VLPs,不仅在结构上与原始病毒的结构相近,而且容易纯化,可以获得高产量、高纯度的抗原,适用于血清抗体的检测,以及病毒疫苗的开发研制。目的利用杆状病毒表达系统(Baculovirus expressing system),在昆虫Tn5细胞中表达PBoV的主要构造蛋白VP2,以期获得PBoV的类病毒颗粒(PBoV-LPs)。以PBoV-LPs为抗原,建立酶联免疫法(ELISA),检测抗-PBoV抗体,进而探讨PBoV的血清流行病学的特征。同时研究PBoV的免疫原性及免疫反应性,为PBoV疫苗的研制开发奠定基础。也为未知病毒的抗原性的研究建立一套研究体系和研究模型。方法1.运用PCR法,扩增PBoV的VP2基因,将VP2基因克隆到TA克隆载体,并进行大量扩增。2.构建VP2基因转移载体pVL1393-VP2,与线性化的杆状病毒DNA,一起转染昆虫细胞Sf9,得到重组杆状病毒Ac[VP2]。之后,在Sf9细胞中,使其大量扩增。3.将重组杆状病毒Ac[VP2],感染BTL-Tn5B1-4 (Tn5)细胞,进行蛋白表达。动态观察蛋白表达：将细胞内的蛋白、上清中的蛋白进行SDS-PAGE电泳,考马氏亮蓝(Coomassie blue)染色后,观察细胞内蛋白的表达,以及培养上清中蛋白的分泌,以确定回收蛋白的时间。4.收集培养7天后细胞上清液,离心、4℃重悬过夜后,进行CsCl密度梯度离心纯化蛋白。用蛋白测序方法,检测蛋白质N端氨基酸序列,验证VP2蛋白的准确性。Uranyl acetate染色后,电镜下观察类病毒颗粒。5.将PBoV-LPs免疫家兔,获取抗PBoV-LPs抗体。利用该抗体和其它病毒颗粒的免疫反应,来确认PBoV-LPs与HBoVs、以及PCV2-LPs的交叉反应性。6.建立抗体检测的方法,通过检测家猪和野猪血清中抗PBoV IgG抗体,了解PBoV的流行病学状况。7.检测家猪和野猪血清PBoV的DNA,明确家猪和野猪中流行的PBoV的分子生物学特征。结果1.重组杆状病毒AC[VP2]感染的Tn5细胞中,检出PBoV VP2蛋白,其分子量约为61.5KDa,细胞内蛋白的表达高峰,在感染后第三天到第五天,之后开始递减；上清液中的蛋白,在感染后第三天开始检测到,之后逐渐增多；感染后第7天,上清液中蛋白量达到高峰。2.感染后第七天收集细胞培养上清液,CsCl密度梯度离心法纯化蛋白。分子量约为61.5KDa的蛋白质集中在收集管8,9,10,密度为1.300g/cm3。电镜下观察到直径约为30nm的类病毒颗粒,形状和原始病毒相似。蛋白质序列分析显示,类病毒颗粒的N端5个氨基酸序列,与PBoV VP2蛋白的序列完全一致。说明VLPs是由PBoV VP2基因表达而来,而且PBoV VP2蛋白可以自行装配成类病毒颗粒(VLPs)。3.为验证病毒颗粒内部是否包被了核酸,利用MagNA Pure LC Total NucleicAcid Isolation Kit (Roche Applied Science)试剂盒,从类病毒颗粒中提取核酸,然后将提取物进行琼脂糖凝胶电泳,进行观察。结果显示颗粒内部未检测到核酸。4.将病毒颗粒免疫家兔,进行ELISA试验,检测抗体的效价。比较免疫前后兔血清中的抗体,免疫前兔血清中未检出抗体；免疫后的兔血清中,抗PBoV-LPsIgG抗体的滴度高达1：409,600,说明PBoV-LPs具有良好的免疫原性。5. PBoV与HBoVs的抗原性比较：通过ELISA法检测抗PBoV-LPs抗体与HBoV-LPs、抗HBoV-LPs抗体与PBoV-LPs的交叉反应性,来比较PBoV与HBoVs的抗原性的差别。发现兔抗-PBoV IgG与HBoV1-LPs和HBoV2-LPs均反应,但不与HBoV3-LPs和HBoV4-LPs反应。而PBoV-LPs,可与兔抗-HBoV1,2,3,4-LPs IgG发生交叉反应,但弱于同源抗原抗体间的反应。说明PBoV可与HBoVs之间有相同的抗原决定簇存在。PBoV-LPs不与兔抗-PCV2-LPs IgG反应,PCV2-LPs也不与兔抗-PBoV-LPs IgG发生反应,说明PBoV与PCV2抗原性完全不同。6.家猪和野猪的抗PBoV IgG抗体携带率：以PBoV-LPs作为抗原进行ELISA试验检测抗体。检测了194份家猪和259份野猪血清,其结果,家猪血清抗体阳性率高于90.7%(176/194),野猪血清抗体阳性率平均为59.5%(154/259),证明PBoV的感染在家猪和野猪中是很普遍的现象。7. PBoV的病毒核酸检测：利用巢式PCR扩增PBoV NS1部分基因,调查家猪及野猪的病毒携带状况。从259份野猪血清中共检出7份血清PBoV DNA阳性,其中兵库县采集的血清中有4份,茨城县2份、长崎县1份。核苷酸序列分析结果表明,这7例病毒DNA属于PBoV G3型基因组,并可以细分成4个亚型基因组,有明显的地域区别。家猪血清样本中,并未检出病毒DNA,其原因在于,90%以上的家猪都已有抗体,病毒已被清除。结论1.本课题成功地利用杆状病毒表达体系,合成了猪博卡病毒类病毒颗粒(PBoV-LPs),并完成类病毒颗粒的鉴定,包括蛋白的表达量、直径、电镜形态、分子量、颗粒密度、和免疫原性等生物学指标。PBoV-LPs猪博卡病毒类病毒颗粒具有天然VP2蛋白的特性及免疫原性,可作为抗原用于抗体的检测以及疫苗的研制。2.应用纯化的PBoV-LPs作抗原,建立了抗体检测的ELISA方法。并用此方法对PBoV的抗原性进行了比较。发现PBoV可与HBoVs发生交叉反应,PBoV与PCV2的抗原性完全不同。3.对家猪和野猪的PBoV的感染状况,进行了流行病学调查：发现在家猪和野猪中,PBoV的感染都很普遍。家猪的感染率更高,和饲养环境有密切关联。从野猪标本中检出的PBoV DNA序列分析表明,PBoV的感染存在多样化、地域性差异等特点。