逆境胁迫严重影响植物的生长发育和生产力。植物必须在分子、细胞、生理和生化水平上响应环境胁迫,通过复杂的基因调控网络,使植株做出相应的适应性调整,以求在逆境条件下得以生存。二氧化硫(Sulfur dioxide, SO2)是一种常见的全球性大气污染物。本文以模式植物拟南芥(4周龄)为材料,用浓度30mg/m3的S02暴露72h后,对拟南芥的基因表达谱、DNA甲基化特征、microRNA (miRNA)表达模式等进行了分析,研究SO2胁迫下拟南芥防御基因的差异表达及表观遗传调控机制,从DNA和转录水平上揭示植物对逆境适应的分子机制。根据ATH1芯片检测结果,对拟南芥地上组织细胞基因表达谱进行分析,在全基因组中共检出胁迫组和对照组间差异表达2倍以上的基因494个(|R|>2),其中上调表达220个,下调表达274个,主要涉及细胞代谢、结合、转录调控、结构分子、信号转导、物质运输等过程。S02胁迫后,抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)基因表达水平和酶活性增加,抗逆相关的防御基因如谷胱甘肽硫转移酶(GST)、细胞色素P450、热激转录因子、热激蛋白等转录水平提高。同时,参与抗病反应的病程相关蛋白基因、次生代谢相关基因(苯丙烷类代谢途径)、细胞壁形成相关基因(纤维素合成酶、伸展蛋白及木质素合成相关)等表达上调,诱导植物产生对多种环境胁迫的交叉抗性。对9个差异表达防御基因进行RT-PCR分析,结果表明SO2胁迫后这9个基因转录水平提高,与芯片结果一致,证明由基因芯片筛选出的差异表达基因信息是可靠的。SO2胁迫诱导拟南芥胞内超氧阴离子(O-·)和过氧化氢(H2O2)水平升高,生长素、乙烯生物合成和信号转导途径相关基因激活,活性氧和植物激素等多条途径参与了拟南芥对SO2的防卫应答反应,从而提高植株对逆境的适应性。利用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术分析拟南芥基因组DNA中CCGG位点甲基化状态。结果表明,采用12对随机引物组合,共扩增出703条清晰的谱带,SO2胁迫诱导胞嘧啶甲基化特征改变,甲基化多态性为37%,未甲基化和半甲基化位点减少,全甲基化位点增多,基因组DNA总甲基化水平增高,从而有利于胁迫条件下植物基因组的稳定。利用亚硫酸氢盐修饰后测序(Bisulfite sequencing, BS)技术分析SO2胁迫应答基因RD29A、类胡萝卜素裂解双加氧酶(CCD7)、腈水解酶(NIT2)和ACC合成酶(ACS6)的甲基化状态。结果表明,在正常生长条件下,RD29A和CCD7基因启动子检测区域中未发现甲基化,NIT2和ACS6基因启动子检测区域中的CG、CHG和CHH (H代表A、C或T)位点存在不同程度的甲基化。SO2胁迫后,RD29A和CCD7基因启动子区保持无甲基化状态不变,而NIT2和ACS6基因启动子区不同位点甲基化水平升高或降低,总甲基化水平降低。同时,NIT2和ACS6基因的转录水平提高,说明SO2胁迫诱发拟南芥基因胞嘧啶甲基化水平改变,启动子区甲基化水平的降低可能与防御基因的诱导表达有关,DNA甲基化修饰参与了植物的抗逆生理过程。RT-PCR分析结果表明,SO2胁迫后拟南芥多个miRNA诱导表达,miR162a、miR167a、miR167c、miR319c的表达量增加：miR398a. miR398c的表达量降低,其靶基因Cu/Zn超氧化物歧化酶(CSD1和CSD2)的转录水平增加,二者表达变化呈负相关。胁迫诱导miRNA前体上游序列分析后发现,该区域存在大量的胁迫响应元件、激素响应元件,对miRNA自身的表达起到关键的调控作用,说明miRNA上游的调控因子与下游的靶标组成了一个完整的调控网络,逆境诱导miRNA表达改变对其靶基因进行负调节,参与植物的胁迫响应与抗逆调控。研究结果表明,S02胁迫激活拟南芥胞内活性氧(H2O2)、植物激素(生长素、乙烯)等多条信号转导途径,诱导SOD、POD、 GPX, GST,细胞色素P450等多个防御基因表达水平提高。同时,热激转录因子、热激蛋白、抗病基因等表达上调,从转录水平上显示了植株对多种环境胁迫的抗性增强。拟南芥DNA甲基化特征改变对植物基因组稳定和基因转录调节具有重要作用,miRNA表达模式的改变对其靶基因进行负调控,SO2胁迫诱导的表观遗传修饰参与了抗逆基因的转录调节,是植物对逆境的一种适应性反应。