1.背景和目的： 包含中国华南地区在内的世界范围内，原发性的肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常见的恶性肿瘤之一。与其它肿瘤类似，肝癌的形成是多步骤的过程。尽管被广泛的研究，促使肝癌发生的潜在分子机制仍然不是很明确。过去几十年中，在理解机体对病毒、药物和环境污染物的不同反应的遗传基础有了惊人的进步。大量研究显示，某些基因的等位基因变异可以作为HCC的诊断标记物。与机体病毒侵入、肿瘤发生和解毒过程相关的基因遗传差异也许有助于预测个体患病的易感性和早期诊断，从而可以极大改善治愈率。 2.材料和方法： 410份华南地区健康汉族人的基因组GRP78基因的PCR产物直接被测序，包括了该基因的启动子区、所有的外显子区、3’非翻译区(3 untranslated region，3 UTR)，和大部分的内含子。在年龄和性别上与正常对照组相匹配的392份HBV感染组和428份HCC组，针对所发现的SNPs，在荧光定量PCR仪(ABI Prism7900HT，Applied Biosystems，Foster City，CA)上使用TaqMan MGB—probes基因分型技术，或使用测序技术进行基因分型。连锁不平衡(Linkage disequilibrium，LD)和单体型(haplotypes)的构建使用Haploview version3.2。双体型(diplotypes)的构建通过以最大期望值(expectation—maximization，EM)算法为基础的PENHAPLO程序实现。HBV感染的血清学标记物的检验通过酶联免疫吸附检验(enzyme—linked immunosorbent assay，ELISA)或常规化学检验。HBV DNA的定量通过使用商品化的HBV荧光定量PCR诊断试剂盒(Shenzhen PG Biotech，China)，并在LightCyclerTM Systems(Roche Diagnositc，Rotkreuz，Switzerland)上进行。 通过GENEPOP version4.0遗传软件检验对照组及疾病组基因型分布的Hardy—Weinberg平衡。Chi—square检验被用在疾病组和对照组在性别、吸烟和饮酒习惯上的可能差异。而他们在年龄上的可能差异使用Mann—Whitney U—检验。疾病组和对照组(或不同疾病组之间)在等位基因、基因型、单体型和双体型水平上的差异，使用校正了年龄、性别、吸烟和饮酒习惯的无条件logistic回归模型，同时计算优势比(odds ratios，OR)和95％的可信区间(confidence intervals，CIs)。HBV组中，血清HBV DNA的水平与等位基因、基因型、单体型和双体型的联系，使用单因素的方差分析(One way analysis of variance，ANOVA)和Bonferroni检验。所有的统计都是双侧检验。以P值小于0.05或小于保守性的阈值为具有统计学意义。保守性阈值是根据SNPs之间的连锁不平衡关系，由SNPSpD program校正而来。 HCC病人的随访中位数时间是28个月(从6到60个月)。数据的收集来自于至少以下的一点：住院病例记录，和直接联系病人或其家属。从HCC的最初确诊日期到病人的死亡日期是总的生存时间(overall survival，OS)。病人生存到随访的最后一日，则生存时间被当作截尾(censored)值。随访的结束日期是2008年10月。在这个过程中，有331个HCC病人死亡(占77.33％)，35个病人生存(占8.17％)，62个病人失访(占14.48％)。Kaplan—Meier生存曲线和log—rank检验被用来评估HCC病人的总的生存时间和不同等位基因、基因型、单体型及双体型的关系。为了防止混杂交互作用的影响，多变量的Cox回归模型被用来分析HCC的独立预后因子。 3.结果： 3.1.汉族人中GRP78基因的多态性 汉族健康人群的GRP78基因PCR产物的直接测序结果，是找到了9个SNPs(频率>1％)。令人感兴趣的是，在第一个外显子转录起始位点之前，鉴定到一个新的SNP(+119bpT>A，gtgaccccgggcccc[T>A]gccgcctgcaagtcg)。据我们所知，它不存在于dbSNP数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)和HapMap Project(http：//www.hapmap.org)中。在所有的编码区(coding sequences，CDS)都没有发现SNP，暗示了GRP78蛋白进化上的保守性。Rs391957/rs11355458(D’=1，r2=1.00)，rs1140763/rs12009(D=1，r2=0.81)分别处于完全连锁或紧密连锁状态。根据连锁不平衡模式分析单体型，显示有3个区块(block)：区块1(启动子区)—(rs391957，rs17840762，rs17840761和rs11355458)，区块2-(+119bp和rs430397)，区块3(3 UTR)—(rs16927997，rs1140763和rs12009)。其中，区块1含有4个单体型和9个双体型；区块3有3个单体型和6个双体型。 3.2.GRP78基因的多态性与HBV风险、急性恶化和预后的相关性 通过校正年龄、性别、吸烟和饮酒的状态，logistic回归分析显示，对照组分别与HBV感染组、HBeAg阴性感染组、HBeAg阳性感染组、丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)正常感染组、ALT异常感染组相比，在不同的等位基因、基因型、单体型和双体型水平，均没有统计学意义(P>0.05)。我们也发现，在不同的等位基因、基因型、单体型和双体型水平，ALT异常感染组与ALT正常感染组相比、HBeAg阳性感染组与HBeAg阴性感染组相比，均没有统计学差别(P>0.05)。此外，在不同的等位基因、基因型、单体型和双体型水平，HBV组内的DNA病毒载量也没有统计学区别(P>0.05)。 3.3.GRP78基因的多态性与HCC风险和预后的相关性 在启动子区的不同的等位基因、基因型和双体型水平，HCC疾病组与正常对照组之间均没有统计学区别。但是单体型ACCG与增加的HCC风险相关(OR1.45，95％CI1.08-1.87，P=0.009)。新SNP(+119bp)的等位基因和基因型与HCC的风险也没有相关性。Rs430397的等位基因A和基因型AA显著增加HCC的患病风险(OR=1.42，95％CI=1.09-1.84，P=0.009；OR=2.26，95％CI=1.10-3.46，P=0.013)。在3UTR的不同的等位基因、基因型、单体型和双体型，均与HCC的风险无关。 我们调查了HCC病人总的生存时间与GRP78基因多态性的关系。在启动子区，rs391957等位基因A和杂合子AG，rs11355458等位基因G和杂合子dG(d，缺失碱基)，单体型ACCG的生存时间较短(中位数27月，log—rank P=0.015；中位数27.0月，log—rank P=0.032；中位数27月，log—rank P=0.015；中位数27.0月，log—rank P=0.032；中位数27.0月，log—rank P=0.013)。此外，rs430397等位基因A(中位数28月，log—rank P=0.008)和纯合子基因型AA(中位数21月，log—rank P=0.010)的生存时间也较短。然而，+119bp和3UTR的多态性与生存时间没有相关性(log—rank P>0.05)。多因素的Cox回归模型分析显示，肝硬化(RR=5.012，P=0.015)和rs430397等位基因(RR=3.155，P=0.039)是HCC的独立预后因子。 4.结论： 4.1.建立了高通量的基因测序平台和TaqMan荧光探针基因分型平台。 4.2.在汉族人中，总共发现GRP78基因有9个SNPs(包括一个新的SNP)。启动子区有4种单体型和9种双体型；3UTR有3种单体型和6种双体型。Rs391957/rs11355458完全连锁；rs1140763/rs12009紧密连锁。这些信息有助于在下一步的病例—对照研究中，可以减少基因分型的数目。 4.3.GRP78基因多态性(等位基因、基因型、单体型和双体型)与HBV感染的风险、急性恶化和预后都没有相关性。 4.4.GRP78基因启动子区单体型ACCG和内含子区rs430397多态性(等位基因A和基因型AA)增加患HCC的风险。 4.5.携带rs391957等位基因A和基因型AG，rs11355458等位基因G和基因型dG，启动子单体型ACCG，或内含子rs430397等位基因A和基因型AA的HCC病人显示较短的中位数生存时间。 4.6.肝硬化和rs430397是HCC的独立预后因子，影响HCC病人的预后。