【摘 要】
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聚类规则的间隔短回文重复/CRISPR相关蛋白(CRISPR/Cas)基因编辑系统是当前最新的基因编辑平台。由于应用方式简单且高效,CRISPR/Cas系统已被应用于DNA编辑、RNA编辑、基因调控、表观遗传编辑、染色质工程以及生物成像等各个方面。然而,要想实现对CRISPR/Cas系统的有效应用,就需要将该系统高效率的投递到靶细胞中。迄今为止,人们已经尝试使用包括物理方法、病毒载体和非病毒载体在
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聚类规则的间隔短回文重复/CRISPR相关蛋白(CRISPR/Cas)基因编辑系统是当前最新的基因编辑平台。由于应用方式简单且高效,CRISPR/Cas系统已被应用于DNA编辑、RNA编辑、基因调控、表观遗传编辑、染色质工程以及生物成像等各个方面。然而,要想实现对CRISPR/Cas系统的有效应用,就需要将该系统高效率的投递到靶细胞中。迄今为止,人们已经尝试使用包括物理方法、病毒载体和非病毒载体在内的多种方法对CRISPR/Cas系统进行投递。然而物理方法对细胞的毒性及病毒载体对被投递物尺寸上的限制仍然是研究人员们难以解决的问题。非病毒载体则因其较低的免疫原性、较强的装载能力且易于被大规模生产的特质成为了近年来人们研究的焦点。考虑到目前已被报道的非病毒载体往往设计和制备方式较为复杂,本文以疏水蛋白HFBI及近红外荧光探针BODIPY复合形成的BODIPY-HFBI作为新型非病毒型CRISPR/Cas9基因编辑系统投递载体,实现了CRISPR/Cas9系统体内外的高效投递。本文具体研究内容及结果如下:(1)本文通过将疏水蛋白HFBI与荧光探针BODIPY共同超声制备了BODIPY-HFBI,随后使用TEM、SEM、Zeta等多种方式对其进行了一系列表征。结果显示BODIPY-HFBI粒径大小主要集中于10-30 nm,稳定性较强。此外,在共聚焦显微镜下,BODIPY-HFBI被证明可以有效进入Hela细胞的细胞核,展示了其作为投递载体的巨大潜力。(2)本文通过AKTA系统纯化Cas9蛋白且转录靶向eGFP的sgRNA在体外重建了CRISPR/Cas9系统,并利用该系统对eGFP基因的有效切割验证了系统的活性;随后将该系统与投递载体BODIPY-HFBI共孵育构建了投递系统RNP/BODIPY-HFBI并利用SEM、Zeta等方式对系统进行了表征。结果显示,投递系统粒径主要位于20-45 nm之间,稳定性较强,且仍然具有良好的荧光性质及切割能力。(3)最后本文对该系统体内外的基因编辑能力进行了验证。结果显示该投递系统在体外可以有效的敲除Cos7-eGFP细胞中的eGFP基因,并显著降低eGFP蛋白的表达;在体内可以有效抑制Mcf-7肿瘤的生长,且免疫原性极低。鉴于以上研究结果,投递系统RNP/BODIPY-HFBI有望被应用于不同的CRISPR/Cas系统中并提高这些系统的工作效率。除此之外,此课题展现了BODIPY-HFBI作为投递载体有效性,为如何利用疏水蛋白构建载体提供了一种全新的思路。
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