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大量研究表明,许多环境污染物具有内分泌干扰作用,特别是其对男性生殖功能的影响已引起了人们的高度重视。有机氯农药DDT (2,2-bis(4-chlorophenyl) -1,1, 1-trichloroethane)和六六六(benzene-hexachloride, BHC)等是污染范围广、危害大、在环境中存留时间长并可通过食物链的生物放大作用而进入机体的持久性有机污染物(persistent organic pollutants,POPs),可在机体脂肪组织和血脂中存留数十年,且主要以其代谢产物p,p’-DDE和β-BHC的形式存在。因此人们认为,p,p’-DDE是DDT在环境和机体内最持久浓度最高的代谢产物,而β-BHC是六六六在环境和机体内难于降解的浓度最高的代谢产物。已有研究表明,p,p’-DDE和β-BHC属于环境内分泌干扰物(EDCs),被列为优先消除的持久性有机污染物(POPs)。鉴于其远期的重大影响,环境抗雄激素以及相关的环境和生殖问题的研究已经成为目前研究的热点。有关p,p’-DDE或β-BHC内分泌干扰健康效应的报道也开始逐渐增多,但其单独作用以及两者联合作用对生殖系统机制的研究不是很多,尤其是p,p’-DDE或β-BHC诱导支持细胞凋亡的影响鲜有报道。而本研究的主要目的就是以支持细胞作为靶细胞,以p,p’-DDE与β-BHC为受试物来初步探讨进而揭示p,p’-DDE和β-BHC对支持细胞凋亡的可能作用机制。这也是本实验的创新点。第一部分大鼠睾丸支持细胞的离体培养及p,p’-DDE、β-BHC及其联合作用对支持细胞的活力影响目的:探讨p,p’-DDE、β-BHC及其联合作用对支持细胞活力的影响来确定细胞的作用剂量。方法:对离体培养的支持细胞分别用10μmol/L、30μmol/L、50μmol/L、70μmol/L p,p’-DDE、β-BHC及10μmol/L、30μmol/L、50μmol/L p,p’-DDE、β-BHC联合染毒24 h后用MTT比色方法测其在490 nm的吸光度值。结果: p,p’-DDE、β-BHC 50μmol/L、70μmol/L与溶剂对照组有显著性差异(P <0.05);p,p’-DDE与β-BHC联合染毒50μmol/L与溶剂对照组有显著性差异(P <0.05);其他浓度组与溶剂对照组没有显著性差异。结论:可以确定浓度高于50μmol/L的p,p’-DDE及β-BHC可以影响支持细胞的活力。p,p’-DDE、β-BHC联合作用对支持细胞活性的影响大于两者单独作用。第二部分p,p’-DDE、β-BHC及其联合作用对支持细胞凋亡的影响目的:检测p,p’-DDE、β-BHC及其联合作用对支持细胞凋亡的影响。方法:应用吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)双重荧光染色对经过不同浓度(10、30和50μmol/L)的p,p’-DDE、β-BHC及其联合处理24 h的支持细胞及先用Caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO处理2 h再用50μmol/L p,p’-DDE与β-BHC联合处理24 h的支持细胞进行测定。结果:支持细胞的凋亡率随着p,p’-DDE、β-BHC及其联合作用浓度的增大而提高(P<0.05),p,p’-DDE、β-BHC及其联合染毒各剂量组与Caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO组比较,差异有统计学意义(P <0.05)。第三部分p,p’-DDE、β-BHC及其联合作用对支持细胞Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 mRNA转录水平的影响目的:通过测定p,p’-DDE、β-BHC及其联合作用对支持细胞作用后Caspase-3、Caspase-8及Caspase-9 mRNA的表达情况,探讨p,p’-DDE、β-BHC及其联合作用对支持细胞内Caspase蛋白的影响,为进一步探索其作用机制提供依据。方法:用RT-PCR方法检测支持细胞内Caspase-3、Caspase-8及Caspase-9 mRNA的表达情况。结果:支持细胞内Caspase-3、Caspase-8及Caspase-9 mRNA随着p,p’-DDE、β-BHC及其联合浓度的增加而表达增加。结论:p,p’-DDE、β-BHC及其联合在mRNA水平上可以增加Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的表达。第四部分p,p’-DDE、β-BHC及其联合作用对支持细胞Caspase-3、Caspase-8及Caspase-9蛋白表达的影响目的:探讨p,p’-DDE、β-BHC及其联合作用对支持细胞的Caspase凋亡途径是否有影响。方法:用Western blotting方法来半定量在p,p’-DDE、β-BHC及其联合作用不同浓度及不同作用时间内的Caspase-3、Caspase-8及Caspase-9蛋白的表达情况。结果:不同浓度的p,p’-DDE、β-BHC及其联合处理支持细胞细胞24 h后,Caspase-3、Caspase-8及Caspase-9酶原蛋白带均变细,随染毒浓度增加,酶原与β-actin的灰度值之比逐渐减小,即Caspase-3、Caspase-8及Caspase-9酶原裂解增加。相同浓度高剂量组p,p’-DDE、β-BHC及其联合处理支持细胞细胞不同时间后,Caspase-3、Caspase-8及Caspase-9酶原蛋白带也变细,随着染毒时间延长,酶原与β-actin的灰度值之比也逐渐减小。Caspase-3、Caspase-8及Caspase-9酶原蛋白的裂解,随着毒物作用浓度的升高,毒物作用的时间延长而增强。结论:p,p’-DDE与β-BHC对大鼠睾丸支持细胞凋亡可能起着协同作用。从上述结果可以看出:1. p,p’-DDE、β-BHC及其联合引起支持细胞的凋亡的发生。支持细胞是曲细精管中唯一的体细胞,对于精子的发生具有不可替代的作用。p,p’-DDE是一种环境抗雄激素,β-BHC是环境拟雌激素,两者单独或联合作用引起支持细胞的凋亡,这必然影响到生殖细胞功能从而导致生精功能的紊乱。2. p,p’-DDE、β-BHC及其联合可以明显提高Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9 mRNA表达量。3. p,p’-DDE、β-BHC及其联合可以活化酶原形式的Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9,减少其表达;50μmol/L p,p’-DDE、β-BHC及其联合呈时间依赖性促进酶原形式的Caspase-3、Caspase-8及Caspase-9的活化。综合第二点、第三点可以看出p,p’-DDE与β-BHC对支持细胞的作用机制除了公认的激素受体途径之外还可以通过细胞凋亡通路。凋亡细胞的形态变化大多由胱天蛋白酶系(Caspases)引发,一旦胞内的这些酶被特异性激活,细胞即进入凋亡。Caspase一经活化导致底物裂解细胞凋亡将不可逆地进行下去,因而又成为凋亡的重要标志。在Caspase级联反应中,Caspsse-3是下游一个重要的公共凋亡效应因子,在各种因素引发的凋亡程序中起最后的枢纽作用。支持细胞在给予p,p’-DDE、β-BHC及其联合染毒24 h,细胞凋亡率随着毒物浓度的增加而增加,且凋亡可以被Caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO所抑制,表明p,p’-DDE、β-BHC及其联合所致支持细胞的凋亡是通过Caspase-3途径产生作用。Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9 mRNA表达随着p,p’-DDE、β-BHC及其联合浓度的增加而增加,且其酶原呈剂量及时间依赖性减少,表明凋亡是通过激活启动Caspase-8和Caspase-9,进而激活下游效应Caspase-3的级联反应来实现。本研究为进一步研究其具体的作用途径提供了实验依据。