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研究背景支气管哮喘(简称哮喘)具有特征性的病理学表现,即气道炎症和气道重塑。目前的研究普遍认为,气道重塑是哮喘患者发生固定性气流受限、存在肺功能受损的结构基础。气道重塑存在以下病理学方面的特征性表现:上皮结构及功能紊乱、平滑肌细胞的增生与肥大、血管重构、细胞外基质沉积和网状基底膜增厚等。通常,气道上皮暴露于各种环境刺激之下,上皮细胞受到损伤,并发生自身修复,在这一过程中上皮细胞会分泌多种因子,如胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)、卵泡抑素样蛋白1(FSTL1)、白介素33(IL-33)等。研究发现这些因子皆可通过不同机制促进细胞外基质沉积及气道重塑。成纤维细胞则可以合成并分泌多种细胞外基质和胶原;受到内源性及外源性刺激之后,成纤维细胞的合成与分泌功能可能会紊乱,这亦会诱导并加剧气道重塑。TSLP是一种与哮喘密切相关的因子,从多个方面参与了哮喘的病理生理学过程,包括气道重塑。TSLP与对应的受体结合后可以通过一系列的下游信号分子参与调控细胞的各项生命活动,这些信号分子包括白介素13(IL-13)、信号传导与转录激活因子3(STAT3)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)等。经典的MAPKs包括细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)、C-Jun氨基末端激酶(JNK)/p38及ERK5。先前的研究表明ERK1/2、JNK及p38都与哮喘有一定关系,而ERIK5主要参与内皮细胞的功能调控,与哮喘联系不甚紧密。迄今为止,国内外研究表明气道上皮细胞和成纤维细胞均在哮喘的发生发展中发挥了举足轻重的作用,而TSLP在哮喘相关的气道炎症中至关重要。但是关于气道上皮细胞和成纤维细胞之间的相互作用的研究,TSLP对气道重塑的影响的研究及三者之间相互作用对气道重塑的影响的研究尚显不足。研究目的:1.探究人肺成纤维细胞内TSLP-p38-STAT3信号通路对哮喘的气道重塑的影响;2.研究哮喘患者气道上皮细胞分泌的TSLP对人肺成纤维细胞中TSLP-p38-STAT3信号通路的影响;3.实验动物采用p38抑制剂(SB203580)干预,观察干预p38-STAT3信号通路后对哮喘气道重塑的影响。研究方法1.从哮喘患者(n=10)和正常对照人群(n=10)(遗体捐献或纤维支气管镜活检)分别获取肺组织标本,采用苏木精-伊红染色法(H&E)观察哮喘患者气道组织重塑相关的病理学表现,采用免疫组织化学染色法(IHC)观察TSLP、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及1型胶原蛋白(Collagen I)在肺组织中的表达情况。2.分别用ERK1/2、p38和JNK的抑制剂处理人肺成纤维细胞(HLF-1),采用western blot检测相应下游STAT3磷酸化水平,α-SMA及I型胶原蛋白的表达情况;并采用细胞免疫荧光的方法加以验证。3.将人类哮喘原代支气管上皮细胞(PCS-300-011)与人类正常支气管上皮细胞(BEAS-2B)分别与HLF-1共培养,加入人重组TSLP和SB203580,采用酶联免疫吸附(ELISA)的方法检测共培养体系培养基中TSLP的浓度,同时采用western blot的方法检测共培养体系中HLF-1细胞内的STAT3的磷酸化水平,及气道重塑标记物的表达情况。4.动物实验中,腹腔注射SB203580,利用western blot和IHC等方法检测SB203580是否影响哮喘的气道重塑。研究结果1.H&E表明,哮喘患者的肺组织标本存在重塑相关的病理学表现。同时IHC显示哮喘患者的TSLP,α-SMA和collagen I的表达量均较正常对照组增高。2.向HLF-1中加入SB203580后,p38和STAT3的磷酸化水平受到抑制;加入TSLP,p38及STAT3磷酸化水平升高,Collagen Ⅰ和α-SMA表达增多;而与单独加入TSLP组相比,同时加入SB203580和TSLP后,p-p38、p-STAT3、collagen Ⅰ和α-SMA表达均出现了降低。ERK和JNK的抑制剂则不具有类似的作用。细胞免疫荧光揭示了同样的结果。3.通过ELISA检测共培养体系培养基中TSLP的浓度,结果表明,哮喘原代支气管上细胞可以分泌更高水平的TSLP。哮喘原代支气管上皮细胞与HLF-1共培养组中,HLF-1细胞内STAT3磷酸化水平升高,Collagen Ⅰ和α-SMA表达增多;而加入SB203580后,STAT3磷酸化水平降低,Collagen Ⅰ和α-SMA表达下降。4.实验动物腹腔注射SB203580,Msson三色染色和IHC皆表明,OVA刺激组小鼠气道周围的胶原明显增加,同时TSLP、α-SMA和collagen Ⅰ表达量较对照组亦有所升高;而SB203580处理组小鼠气道的胶原沉积情况有所改善,TSLP、α-SMA和collagen Ⅰ的蛋白表达水平亦出现明显降低的趋势。小鼠肺组织western blot检测揭示了同样的结果。研究结论①哮喘患者气道上皮细胞分泌的TSLP增加,可以通过与气道成纤维细胞表面的受体结合,通过p38-STAT3信号通路,提高气道成纤维细胞α-SMA和collagen Ⅰ的表达量,导致气道重塑加剧;②体内干预p38-STAT3通路,则可以改善实验动物的气道重塑的相关表现,这提示p38-STAT3信号通路可能是治疗哮喘的一个有效靶点。