青花菜遗传转化体系的建立及其BO-ACO基因转化的研究

来源 :莱阳农学院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:terreterre
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以青花菜无菌苗为试材,以MS培养基为基本培养基进行了青花菜离体再生体系的建立以及形态建成过程中生理生化变化的分析。结果表明:在所选用的子叶、下胚轴、茎段、叶片(分带主脉和不带主脉)、叶柄外植体中,以下胚轴和茎段为再生的最适外植体,其芽分化率可达97%;其余所选外植体按芽分化率计依次为子叶、不带主叶脉的叶片切块、带主叶脉的叶片切块、叶柄;外植体取材植株的苗龄不同,其培养后的分化能力不同,萌发后10d的无菌苗和生根15d的试管苗分别为下胚轴和茎段的最佳取材时期;在研究所涉及的生长调节剂中以6-BA/IBA对芽分化最有效,但不同外植体对6-BA/IBA浓度和配比要求不同,下胚轴与茎段外植体以4.0/0.3mg/L为最适;在MS培养基中附加0.1mg/LNAA对试管苗生根时间和生根质量均有良好作用。对青花菜离体再生过程中生理生化变化分析表明,愈伤组织形成、不定芽分化均与其组织内部大分子变化有关。可溶性蛋白质含量在整个过程中呈增加趋势,SDS-PAGE电泳谱带显示伴随外植体组织细胞脱分化、愈伤组织增殖和芽分化有新的蛋白带出现;过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、多酚氧化酶(PPO)活性也随形态发生呈相应的变化趋势。   在此基础上用含有正向BO-ACO2表达载体和反向BO-ACO2表达载体的根癌农杆菌进行了农杆菌介导的青花菜遗传转化体系的研究。结果表明:以子叶和下胚轴为外植体时,芽分化阶段Km的筛选浓度分别为20mg/L和30mg/L时,筛选效果较好;在芽苗生根阶段Km的筛选浓度以15mg/L为宜。抑菌抗生素以羧苄青霉素效果好,使用浓度为300mg/L。预培养提高了转化效果,最佳预培养时间为2d。对转化过程其他参数的研究表明:最佳侵染时间为5min;侵染菌液的最适浓度为OD600=0.2;最适共培养时间为72h;最适宜的维持培养时间为20d。获得了7个拥有外源BO-ACO2基因的整合和卡那霉素抗性基因整合及其表达的转化体,被测阳性转化体达100%。
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