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目的:
比较IgG Fc段编码基因不同构建方式对乙脑DNA疫苗诱导特异性免疫的效应,为JE DNA疫苗的研制提供研究依据。
材料和方法:
一、实验材料
1.细胞与实验动物
鼠肥大细胞瘤细胞(P815)于中国医科大学感染科实验室冻存;BALB/c雌性小鼠,4~6周龄,体重18~20g,购自中国医科大学盛京医院动物实验室。
2、质粒与菌株
JEV prME基因的重组质粒被命名为pJME,pJME/IgG Fc段融合质粒,均由本实验室构建;真核表达载体pcDNA3.1(+)由本实验室冻存;大肠杆菌购自Takara公司。
3、主要试剂
高纯度质粒大提试剂盒购自TIANGEN生化技术有限公司;限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、以及NotⅠ等均购自Takara公司,用于扩增质粒的酶切鉴定;氨苄青霉素购自Sigma公司;琼脂糖购自Takara公司;乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒购自Promega公司,用于检测免疫鼠脾CTL活性;rhIL-2购自上海普欣生物技术有限公司;免疫荧光的抗体(CD16/32,CD4-FITC,CD8-PE)均购自美国BD PharMingen公司,用于检测脾脏T淋巴细胞亚群变化;红细胞裂解液购自碧云天生物技术公司,用于提取小鼠脾脏T淋巴细胞;10%胎牛血清(fatal calf serum,FCS)购自海克隆公司,RPMI-1640细胞培养液购Hyclone公司。
二、实验方法
1、重组表达载体的大量提取与纯化:
根据TIANGEN高纯度质粒大提试剂盒,大量提取pJME、pJME/IgG、pIgG Fc共3种质粒。并用紫外分光光度计检测质粒DNA浓度与纯度,最终调整质粒浓度为1μg/μL。
2、动物和免疫程序:
将BALB/c小鼠随机分为7组,每组小鼠5只,分别将溶于100μL生理盐水的不同免疫原肌肉注射鼠后肢肌肉,包括:pJME、pJME/IgG Fc、 pJME+pIgG Fc、pcDNA3.1(+)(阴性对照组)、JE灭火疫苗组(阳性对照组,剂量相当于1/5成人剂量)。共免疫3次,间隔2周
3、小鼠脾脏细胞的分离
断颈处死小鼠后无菌取脾;将脾脏置于盛有RPMI-1640的平皿中,去脂肪和结缔组织,无菌注射器芯研磨过200目钢网,4℃,10,000rpm,离心10分钟;继用红细胞裂解液溶破红细胞,4℃,1000rpm,离心10分钟,后弃上清;PBS洗2次,每次以800rpm,离心5分钟,弃上清。PBS重悬细胞后制成细胞浓度为1×106/ml的新鲜脾细胞悬液。
4、将制备的脾细胞悬液,用流式细胞仪分析其中的T淋巴细胞亚群的特点,LDH释放法检测CTL活性。
1、质粒的酶切鉴定结果
pIgG Fc经过EcoRⅠ/NotⅠ酶切释出的插入子与IgG Fc基因(729bp)大小相一致,pJME经过EcoRⅠ/BamHⅠ酶切释出的插入子与IgG Fc基因(2001bp)大小相一致,pJME/ IgG Fc经NotⅠ/BamHⅠ酶切释出的插入子为(2730bp),是鼠IgG Fc编码基因与JEV prME蛋白编码基因之和。
2、脾脏CD4+/CD8+T淋巴细胞亚群分析: pJME/IgG Fc组CD4+T淋巴细胞比例为(66.64±5.84)%,明显高于其他组(P<0.05),pJME+pIgG Fc组CD4+T淋巴细胞比例(60.55±2.09)%,高于pJME组(52.86±1.92)%,也高于JE灭活疫苗组(55.77±1.62)%(P<0.05),pcDNA3.1(+)组CD4+T淋巴细胞比例为(37.82±4.93)%,明显低于其他组(P<0.05)。
3、CTL杀伤活性的测定:
各组免疫鼠CTL活性由高至低依次为:pJME/IgG Fc组46.92±1.97%、pJME+pIgG Fc组40.44±0.69%、pJME组34.36±2.14%、JE灭火疫苗组25.29±1.26%、pcDNA3.1(+)组6.62±3.85%,各组见比较,差异有统计学意义,(P<0.05)。
结论:
1、IgG Fc段编码基因能显著提高CD4+T淋巴细胞比例。
2、IgG Fc段编码基因能够增强T细胞对靶细胞的细胞毒效应。
3、相对于pJME+pIgG Fc联合免疫组,pJME/IgG Fc融合质粒免疫组能够诱导更强的细胞免疫反应。