论文部分内容阅读
金黄色葡萄球菌是引起化脓性疾病的重要病原菌,其产生的肠毒素则是世界范围内引起食物中毒的重要原因之一。其中以A型肠毒素引起食物中毒的发生率最高,因此,建立敏感、快速的检测金黄色葡萄球菌A型肠毒素(Staphylococcal aureusenterotoxins A,简称SEA)的方法,是进行食品安全检测,预防食物中毒的必要条件,也有助于金黄色葡萄球菌感染所致化脓性疾病的早期诊断,具有重要的临床意义和卫生意义。抗SEA单克隆抗体的应用,能够有效地提高检测的灵敏度和特异性。目前,国内市场上还不能提供有效的抗SEA单克隆抗体。因此,为了适应临床检测和基础研究的需要,本研究制备了抗SEA单克隆抗体,并在此基础上建立了检测食品中金黄色葡萄球菌A型肠毒素的间接竞争ELISA方法。本试验用SEA经多次免疫BALB/c小鼠后,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在50%PEG的作用下进行融合。用间接ELISA方法初步筛选出能分泌抗SEA单克隆抗体的杂交瘤细胞,用有限稀释法进行克隆化,直到克隆后的细胞孔达到100%阳性,即筛选到了只分泌一种抗体的杂交瘤细胞。本试验共筛选到三株杂交瘤细胞株,分别命名为3C1、3G10和2A10。对其进行鉴定,结果如下:在经4个月的连续传代培养和冻存6个月后复苏检测,其分泌抗体的能力差异不显著,表明其稳定性好;其染色体平均数目在87~98条之间;经亚类鉴定,三株杂交瘤细胞分泌的抗体类型均为IgG1亚类,轻链类型均为k链;ELISA交叉试验和Western-blot分析结果表明,三株抗金黄色葡萄球菌A型肠毒素的单克隆抗体与B型肠毒素、C1型肠毒素无任何交叉反应,且能特异性地与A型肠毒素结合;经抗原表位特异性分析,三株单克隆抗体的识别表位相同或相近;其相对亲和力的测定结果是3C1>3G10>2A10;抗体的效价水平为3C1>3G10>2A10,其中3C1株杂交瘤细胞的腹水效价达1∶819 200。以3C1杂交瘤细胞株的腹水型抗体为原料,建立了检测金黄色葡萄球菌A型肠毒素的间接竞争ELISA方法。通过对试验条件的系列优化,最终确定其反应条件如下:包被浓度为0.8μg/mL,包被条件为37℃2h;封闭条件为0.5%BSA封闭液37℃1h;抗体工作浓度为1∶9 600,样品和抗体的加样比为30∶70,竞争时间为37℃1h;酶标二抗浓度为1∶6000,反应时间为37℃30min;显色条件为37℃避光反应10min。在该反应条件下,获得一条标准曲线,其回归方程为y=-0.2902x+0.8338,相关系数r=0.9952,检测限为0.7311ng/mL,能满足目前对食品中肠毒素的检测要求。批内和批间变异系数分别为,1.22%~13.47%和9.31%~13.47%,具有较好的重复性和精确度;与B型和C1型肠毒素没有任何交叉反应,表明该方法的特异性强。用建立的检测A型肠毒素间接竞争ELISA方法对肉制品中添加的SEA进行检测。其定量限为0.8557ng/mL,平均回收率在60~120%之间,批内和批间变异系数均<20%,说明本试验建立的检测金黄色葡萄球菌A型肠毒素间接竞争ELISA方法可用于临床检测,为金黄色葡萄球菌A型肠毒素检测试剂盒的研制奠定了基础,对预防葡萄球菌性食物中毒具有积极作用。