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犬细小病毒(Canine parvovirus, CPV)是单链DNA病毒,结构蛋白VP2具有中和抗体的抗原表位。CPV可诱发犬患犬细小病毒病,该病是一种烈性传染病,可接触传播,若诊断分离病犬不及时,感染率可达100%。临床表现为出血性肠炎和非化脓性心肌炎,目前本病已广泛流行于全国各地,死亡率平均达50%左右,是危害我国养犬业最为严重的疾病。针对该病的治疗,业内采用对症治疗、支持治疗和的特异性治疗同时进行。前两种治疗方法主要以止血、止吐、止泻及补液为主,只能减轻症状,却不能消除病毒。特异性疗法多采用高免血清、犬细小单克隆抗体进行治疗,但高免血清的效价不稳定,单克隆抗体的制备过程复杂,且存在异源蛋白反应,既不能有效的治疗该病,临床上推广应用也受到限制。羊驼体内存在天然缺少轻链的重链抗体。利用重链抗体克隆构建只含重链抗体可变区的抗体,即单域抗体(variable domain of heavy chain of heavy chain antibody, VHH),在保留完整抗原亲和性的同时,还具有溶解性较好、亲和力高、特异性强、免疫原性弱、分子量小(15kDa左右)、稳定性高等诸多优点。利用噬菌体展示技术,构建抗犬细小病毒VP2蛋白噬菌体抗体基因文库,获得表达量高、特异性强的单域抗体,为治疗犬细小病毒病提供新的思路。本试验主要研究和结果如下：1、犬细小病毒单域抗体库的筛选本课题组前期已经完成了抗犬细小病毒噬菌体抗体库的构建和犬细小病毒VP2蛋白的表达纯化。本实验利用抗原抗体亲和吸附原理,用纯化的VP2蛋白包被96孔板,然后加入活化后的犬细小病毒噬菌体抗体库,使特异性噬菌粒与VP2蛋白结合,再用甘氨酸溶液竞争性洗脱,采用五轮“吸附-洗脱-扩增”富集法,对噬茵体抗体库进行筛选富集,筛选得到对VP2有高亲和力,高特异性噬菌粒,采用菌液PCR对抗体库的阳性率进行检测。回收目的片段,测序,测序结果在NCBI上比对。结果：噬菌体抗体库原始库容1.8×107cfu,活化后库容为3.6×1011cfu,第一次富集后库容为7.8×1011cfu,第二次富集后库容为1.07×1012cfu,第三次富集后为3.24×1012cfu,第四次富集后库容为9.8×1013cfu,第五次富集后库容为3.1×1015cfu。经过五轮免疫亲和筛选,噬菌体抗体库富集增长了近4000倍,PCR结果显示阳性率高达87.5%,目的条带测序,比对结果显示该序列与NCBI上注册的驼科动物的抗体VHH序列相符合,单域抗体库的富集筛选成功。2、犬细小病毒单域抗体表达提取第五次富集后的噬菌粒载体,经过一定量的扩增,然后将其导入到表达菌株E.coil HB2151中,菌液PCR和双酶切实验,检验该菌中是否导入含有目的片段的噬菌粒载体,IPTG诱导目的蛋白VHH的表达,提取目的蛋白进行SDS-PAGE电泳,检测是否有特异性条带。结果：菌液PCR试验中都出现400bp左右条带,质粒提取和双酶切PCR试验显示完整质粒大小为5000bp左右,酶切后出现两条带,一个大小为4500左右,一个400bp左右,蛋白电泳结果可见在14.3KD左右出现条带,说明原核表达系统构建成功,有特异性蛋白表达。3、犬细小病毒单域抗体活性检测对表达的特异性蛋白进行浓缩,利用PCANTAB-5E载体表达的蛋白具有E-Tag标签的特点,设计一抗为兔源Anti-E-Tag,二抗为羊抗兔IgG-HRP,进行western-blot检测。然后再对抗体和抗原进行不同程度的稀释,用ELISA实验检测单域抗体的活性和灵敏度。结果：western-blot实验显示在14.3KD左右有明显条带,且具有生物活性。ELISA实验显示VHH在浓度为15μg/ml的情况下还能和VP2蛋白结合,表明VHH与VP蛋白有较高的结合活性,可检测到的VP2蛋白浓度为250ng/ml,反映出VHH蛋白对犬细小病毒VP2蛋白的高灵敏度。将其用于犬细小病的治疗中,VHH单域抗体治疗可使死亡率降低20%,治愈率提高20%,可缩短治疗周期,使治愈一只犬细小病犬的费用降低10%～20%。