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兰科植物是一个非常庞大的家族,其中许多种类具有重要的观赏与药用价值,多为珍稀濒危植物。1975年全世界所有野生兰科植物就已被列入《野生植物濒危物种国际贸易公约》的保护范围。近年来,由于人为因素的破坏,野生兰科植物资源急剧减少,大量的野生兰花毁于一旦,加强珍稀濒危野生兰花植物的保护迫在眉睫。目前我国兰科植物种质资源的现状不甚乐观,保存手段过于单一,迫切需要建立多种保存技术,形成不同层次的保存体系。本文以密花石斛、石斛杂交后代、海南蝴蝶兰、钩状石斛为材料,进行了离体保存技术研究,以期利用多种保存手段,建立这四种兰花的离体保存技术体系,为它们的种质资源保存提供技术支撑,也为更多兰科植物的保存提供一定的借鉴作用。本试验的主要结果如下：1.建立了密花石斛的无菌播种以及花粉、种子、原球茎的超低温保存程序。①密花石斛无菌播种程序：取人工授粉4个月后的密花石斛蒴果,75%酒精消毒30s,然后0.1%的升汞处理10min。选用1／4MS+100mg／L香蕉泥作为无菌萌发培养基,1／2MS+NAA 2mg／L+50ml／L椰子汁作为壮苗与生根培养基。水苔作为移栽基质。②密花石斛花粉超低温保存程序：新鲜花粉(含水量43.26%)直接投入LN保存,取出,采用室温、自来水冲洗或水浴化冻皆可。其超低温保存后能正常萌发,且萌发率并未下降,用于人工授粉后能正常结实并产生种子。种子无菌播种后能正常萌发形成健壮植株。③密花石斛种子超低温保存程序：含水量为2.78%的种子直接投入LN,取出后自来水冲洗化冻30min。TTC法检测表明种子活力为66.76%,略高于新鲜种子活力65.27%。其超低温保存种子在1／4 MS+100mg／L香蕉泥上能正常萌发,最终发育成健壮幼苗。④密花石斛原球茎超低温保存程序：无菌播种60d后所得的原球茎在附加0.5M蔗糖的MS培养基上预培养4d(室温),之后用Loading溶液室温装载50min,0℃下PVS2玻璃化溶液处理50min,更换新鲜PVS2溶液,快速浸入液氮,取出后37℃水浴解冻60s,Unloading溶液洗涤10min,重复洗涤两次。TTC检测结果显示,原球茎冻后活力可达98.04%。化冻后的原球茎接种于1／4MS+100g／L香蕉泥培养基中暗培养3周,之后移入光下培养,1周后原球茎发白,继续培养7周后原球茎返绿,恢复生长。密花石斛的无菌播种及种子超低温保存程序适用于石斛杂交后代同类材料的离体保存。TTC检测结果显示超低温保存后种子活力为68.11%,略高于新鲜种子活力67.06%,种子能正常生长成健壮幼苗。2.建立了钩状石斛的常温组培保存体系。茎段诱导丛生芽的程序：取一年生茎段,75%的酒精消毒30s,0.1%的升汞处理10min。腋芽诱导培养可采用MS±6-BA2.0mg／L+NAA0.1mg／L,丛生芽的增殖采用MS+6-BA1.0 mg／L+NAA0.5 mg／L,丛生芽的壮苗与生根培养采用MS++NAA0.5mg／L+0.2%AC。移栽基质采用水苔。3.建立了海南蝴蝶兰的无菌播种与植株再生体系。人工授粉4个月后的种子可采用1／4MS+100 mL／L椰子汁进行无菌播种,1／2MS+6-BA2.0 mg／L+NAA0.5 mg／L+100 mg／L香蕉泥可用于原球茎的继代增殖培养,1／2MS+6-BA 0.5 mg／L+NAA 2.0 mg／L+100 mg／L香蕉泥适于原球茎的分化培养。壮苗与生根培养基为MS+NAA0.1 mg／L+100 mg／L香蕉泥。移栽基质采用水苔。