近年来随着集约化养猪的迅速发展,大肠杆菌病的流行日趋严重,此病在仔猪引起严重的腹泻,而且发病率和死亡率都较高。育肥猪阶段,患病猪食欲下降,饲料转化量下降,生长发育受阻,这给养殖户造成很大经济损失。喹赛多是具有抗菌促生长作用的喹嗯啉类新品种。已有研究表明,喹赛多毒性作用小,安全性高,抗菌谱广,可有效促进猪、鸡、鱼等动物的生长,降低腹泻率,并可预防猪和鸡的大肠杆菌病,具有广阔的开发应用前景。然而,目前喹赛多对于猪大肠杆菌腹泻的治疗并没有一个科学的给药剂量。本试验通过在猪回肠部建立瘘管,直接考察喹赛多在猪回肠内的代谢参数,结合回肠内容物的半体内杀菌作用,建立间接体内PK-PD模型,制定喹赛多治疗猪大肠杆菌性腹泻的合理给药方案,尽可能避免耐药菌的产生,从而为喹赛多在临床上的合理应用提供理论依据,延长喹赛多治疗猪大肠杆菌性腹泻的寿命。1.喹赛多对大肠杆菌cvcc223的体外抗菌活性研究采用微量肉汤稀释法测定喹赛多及主要代谢物(Cy1、Cy2、Cy3、Cy4、Cy5、Cy6、Cy7、Cy8、Cy9、 Cy12)对cvcc223的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),主要参考标准为临床实验室标准化研究所(CLSI)制定的相关文件。结果表明,喹赛多在厌氧条件下对cvcc223有较好的杀菌作用,其MIC和MBC分别为1μg/mL和8μg/mL。故喹赛多是一种活性较高的抑菌剂,可推荐用作猪大肠杆菌感染的治疗药物。主要代谢物中,除Cy9(2-甲酰甲酰腙-喹噁啉-N1,N4-二氧化物)具有抗菌活性外,其余代谢物均无抗菌活性,其中Cy9的MIC也是1μg/mL。运用棋盘法进行喹赛多与代谢物的联合药敏试验,得到联合药敏指数FIC=0.5/1+0.5/1=1,表示相互作用为相加作用。采用琼脂培养法测定喹赛多对cvcc223的最小防突变浓度(MPC),在含喹赛多系列浓度的琼脂平板上,接种1010CFU细菌,连续培养72h。结果表明,连续培养72h后,琼脂上无细菌生长的最低喹赛多浓度为20μg/mL,该浓度为厌氧条件下喹赛多对cvcc223的最小防突变浓度(MPC)。根据最低抑菌浓度(MIC)结果,配制32MIC、16MIC、8MIC、4MIC、2MIC、1MIC、1/2MIC的系列喹赛多浓度肉汤进行杀菌试验,接种细菌后,在0.5、1、2、3、4、6、8、12、18、24h后分别取出100gL,系列稀释后采用倾倒法计数。得到各时间点不同浓度存活菌落数后,取活菌数对数值为纵轴,时间点为横轴绘制杀菌曲线。平行试验采用已知为浓度依赖型的恩诺沙星做阳性对照。结果表明,喹赛多杀菌曲线与恩诺沙星类似,均随浓度的增加,杀菌活性增大,表明喹赛多对大肠杆菌的杀菌类型为浓度依赖型。2.喹赛多在猪肠道和血浆中的药代动力学研究试验选用12头体重20kg左右的断奶去势仔猪,按体重随机分为2组,每组6头。在回肠段安装T型瘘管,建立猪回肠瘘管模型。健康猪瘘管模型建立成功,选择一组攻毒大肠杆菌cvcc223,建立患病猪瘘管模型。两组动物均按30mg/kg体重单次灌胃给药。分别于灌胃后在0.5、1、2、3、4、6、8、12、24h取回肠内容物3-4mL和血液2mL。用高效液相色谱法测各时间点回肠内容物和血浆中的喹赛多浓度,结果表明：血浆中的喹赛多最高浓度为0.23μg/mL,浓度较低,不能达到喹赛多的最小抑菌浓度(MIC=1μg/mL),不满足模型要求。健康猪各时间点回肠内容物中喹赛多浓度分别为：2.85、15.89、33.54、27.10、12.78、4.43、2.28、1.10、0.087μg/mL,患病猪各时间点回肠内容物中喹赛多浓度分别为：3.46、17.08、34.32、29.76、14.38、4.52、2.50、1.15、0.093μg/mL,健康猪和患病猪回肠内喹赛多浓度并无明显差别,满足模型要求。通过Winnonlin软件模拟喹赛多在回肠内的代谢参数,经单次口服灌胃后喹赛多在肠内代谢过程均符合延迟性二室模型。喹赛多在猪肠道内代谢较快,达到最高浓度时间Tmax为1.82～2.02h; T1/2α为0.52～0.62h, T1/2β为1.05-1.08h；最高药物浓度Cmax为32.96～34.83μg/mL;有效持续时间T>MIC为7.48-8.18h；曲线下面积AUC为105.0～115.8h·μg/mL;3.喹赛多对大肠杆菌cvcc223的半体内抗菌活性研究考察喹赛多在回肠内容物中的杀菌作用,同样采用微量稀释法,与体外微量肉汤稀释法相同。结果表明,回肠内容物中最小澄清孔的喹赛多浓度为1μg/mL,此浓度下细菌的生长受到抑制,确定喹赛多在回肠内容物中对cvcc223的最小抑菌浓度(MIC)为1μg/mL。考察喹赛多在回肠内容物中的生长状况,用MH肉汤做阳性对照绘制生长曲线。即在24孔板中加入MH肉汤和过滤除菌的回肠内容物,接种细菌后,在0.5、1、2、3、4、6、8、12、18、24h取出,进行菌落计数,得到各时间点活菌落数后,取此对数值为纵轴,时间点为横轴绘制生长曲线。结果表明：大肠杆菌cvcc223在回肠内容物中可以正常生长,其生长曲线与在MH肉汤中的生长曲线基本重合。考察灌胃给药后含喹赛多回肠内容物的半体内杀菌作用,即把不同时间点收取的回肠内容物过滤除菌后,接种细菌cvcc223,放厌氧培养箱。在1、2、4、8、12、24h时,倾倒法活菌计数。得到各时间点活菌落数后,取此对数值为纵轴,时间点为横轴绘制间接杀菌曲线。结果表明：体外培养4h后,高浓度组(>10μg/mL)细菌数目变化最明显,已检测不到细菌；体外培养8h后,低浓度组(2～5μg/mL)菌落变化明显,这表明低浓度喹赛多仍有杀菌作用；体外培养12h后,低浓度组样品出现细菌的反弹生长,表明这些组药物浓度不能抑制细菌生长；体外培养24h后,即使是4h没能检测到细菌的样品组也出现反弹生长,表明体外培养24h后,喹赛多浓度降到其抑菌浓度之下,因此,结合药物代谢结果,灌胃给药12h后药物浓度在其抑菌浓度附近,体外培养12h低浓度组细菌反弹生长,高浓度组仍抑制生长。模型拟合应选用体外培养12h为佳。4.耐药风险评估在无菌细菌瓶中分装含有不同浓度喹赛多0.5.1、2、4、8、16、32μg/mL的MH肉汤,接种细菌约109CFU/mL后厌氧培养。培养适当时间取100μL在含4μg/mL的喹赛多琼脂平板上厌氧菌落计数,菌落数在100CFU内为自然条件下可产生的突变耐药菌,菌落数在100CFU以上为试验条件下额外产生的突变耐药菌。结果显示：在8μg/mL以上浓度培养,除培养72h组,无耐药菌产生；在4μg/mL浓度培养,培养12h后,出现耐药菌；在1μg/mL和2μg/mL浓度培养,耐药菌最容易富集,一般在6-8h后就会出现；空白和0.5μg/mL浓度培养,出现耐药菌情况类似,一般在24h后出现。与耐药突变选择窗(MSW)理论存在差异。试验结果说明,最容易出现耐药亚群富集的浓度稍微高于MIC的浓度,且持续接触6-8h。结合30mg/kg体重灌胃后回肠内代谢结果,若采用每天给药三次,8h内喹赛多药物浓度均高于MIC,理论不会产生耐药菌。若每天给药两次,12h内喹赛多药物浓度在MIC附近的持续时间约为2h,其余时间的喹赛多浓度均高于4μg/mL,理论也不会产生耐药菌。若每天给药一次,低浓度喹赛多持续时间较长,理论上存在产生耐药菌的风险。5. PK-PD模型的拟合与给药方案的制定体外杀菌试验确定了喹赛多对大肠杆菌的抗菌类型为浓度依赖型,拟合模型时参考的PK-PD参数为半体内Cmax/MIC和半体内AUC/MIC。通过Winnonlin软件模拟半体内Cmax/MIC和半体内AUC/MIC值与抗菌疗效(病原菌数目的减少)之间的关系,当E=0、-3、-4(抑菌、杀菌、根除)时,参数Cmax/MIC和参数AUC/MIC对应的半体内药物浓度值为8.52、16.87、24.00μg/mL和7.21、14.27、20.311μg/mL,结果相当。为方便结合给药方程,优化给药剂量,故选用半体内AUC/MIC作为PK-PD模型拟合参数,最终确定拟合PK-PD模型方程为结合给药方程可得给药剂量X(mg/kg/d)。当临床分离菌MIC=1μg/mL,E=0、-3、-4(抑菌、杀菌、根除)时,半体内AUC/MIC/h值分别为86.56、171.28、243.74。对应的X值,即给药剂量为22.58、44.67、63.58mg/kg/d。结果表明,对于大肠杆菌病的预防用药,可按20mg/kg体重给药；治疗用药,可按45mg/kg体重给药；65mg/kg体重给药,理论上可根除细菌,避免耐药菌的产生。参考耐药风险试验的推论结果,每天按治疗剂量给药2-3次可避免耐药菌产生。所以临床治疗为避免耐药菌产生,不推荐每天单次给药,结合临床饲养管理,制定预防给药方案为23mg/kg体重口服给药,每天给药两次。群体饲喂给药方案为0.9g/kg饲料混饲,每天两次。治疗给药方案为45mg/kg体重口服给药,每天给药两次。群体饲喂给药方案为1.8g/kg饲料混饲,每天两次。根除方案为65mg/kg体重口服给药,每天给药两次。群体饲喂给药方案为2.6g/kg饲料混饲,每天两次。综上所述,本课题首次阐明了喹赛多对大肠杆菌的杀菌特性,证明喹赛多属于浓度依赖型抗菌药物。同时首次通过肠道瘘管模型来进行半体内PK-PD模型的拟合,并成功建立了喹赛多对于肠道大肠杆菌的PK-PD拟合方程,确定了喹赛多治疗大肠杆菌腹泻的临床给药剂量,并对临床耐药性的产生进行了初步评估。为临床正确使用喹赛多提供了依据,从而可以减少细菌耐药性的发生。