研究背景：心房颤动(atrial fibrillation, AF)简称房颤,主要表现为心脏节律异常,其特征是快速无序的心房颤动。AF是临床上最常见的心律失常。很多时候并无症状,有时候会感觉心悸、胸痛、气短或者晕厥。AF可以增加中风、心力衰竭和死亡的风险,严重威胁人类健康。心肌梗死发生后除发生室性心律失常外,房性心律失常,尤其是AF的发生亦较常见。尽管AF很重要,我们人类也进行了超过100年的基础和临床研究,我们仍然没有完全理解它的根本机制,也没有彻底掌握如何有效地治疗它。已有研究证实,在AF发生的病理机制中,心房的结构重构、电重构和神经重构对AF的发生、复发和维持可能起着重要的作用,但结构重构很可能比神经重构和电重构扮演更重要的角色。心房的结构重构包括细胞和细胞外间质的改变,其主要表现是心房间质纤维化。而间质纤维化主要发生在细胞外基质,后者的主要成分是胶原。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路是最重要的细胞生长信号调节通路之一,主要包括3个重要的成员酶：ERK、p38、JNK。其中p38 MAPK参与一系列复杂的生物学过程,如细胞增殖、细胞分化、细胞死亡、细胞迁移和侵袭。有研究显示抑制p38 MAPK信号通路可以减少大鼠心室成纤维细胞增殖和胶原合成。另有研究表明,番茄红素通过抑制p38MAPK的活化而改善心功能和心室重构。磷酸化p38(P-p38) MAPK是p38 MAPK的活性状态,是否参与心肌梗死后心房结构重构,目前还不清楚。他汀是3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂,是目前应用最为广泛的调脂药物,已成为治疗高脂血症及防治动脉粥样硬化性疾病的基石。除了调脂作用以外他汀还有一系列有益的生物学效应即“多效性作用”正在被广泛认可,其中包括预防和治疗AF、提高扩张型心肌病患者左心室射血分数(left ventricular ejection fraction, LVEF)、改善心肌梗死大鼠左室的重构和功能等。所以,他汀类药物可通过改善左心室功能、提高LVEF.降低左心房压力进而间接减轻左心房的结构重构。另有实验研究表明,托拉塞米能显著降低心力衰竭大鼠的左室舒张末压(left ventricular end-diastolic pressure, LVEDP)。由于在没有瓣膜病变的情况下,LVEDP可视为左心房压力,因此推论托拉塞米可以降低心力衰竭大鼠的左心房压力,并有可能会进一步间接减轻左心房的结构重构。我们先前对心肌梗死兔使用瑞舒伐他汀灌胃干预8周进行研究观察,研究结果显示瑞舒伐他汀组受损的心房细胞的形态和结构与对照组比较得到改善,提示瑞舒伐他汀可以改善心肌梗死后的心房结构重构。但是他汀有可能通过改善心肌梗死后心室功能,降低心房压力,间接改善心房结构重构。他汀类药物是否直接减轻心肌梗死后心房结构重构的效应,及其机制如何,目前还不清楚。为了观察瑞舒伐他汀对心肌梗死后心房结构重构的直接影响,我们在前期实验研究的基础上采用托拉塞米作为阳性对照药物,来消除瑞舒伐他汀对心肌梗死后心房结构重构的间接影响,试图证实瑞舒伐他汀可以减轻心肌梗死后心房的结构重构,并探讨P-p38 MAPK在心肌梗死后心房结构重构中和瑞舒伐他汀减轻左心房结构重构中所起的作用。研究目的：观察他汀类药物是否直接减轻心肌梗死后心房结构重构的效应,分析P-p38 MAPK在心肌梗死后心房结构重构中作用,并探讨P-p38 MAPK在瑞舒伐他汀减轻左心房结构重构中所起的作用。研究方法：1.心肌梗死模型制作及动物分组体重250～300 g的雄性Wistar大鼠80只。随机选取66只雄性Wistar大鼠麻醉后气管插管、呼吸机辅助呼吸,通过结扎左冠状动脉前降支制作心肌梗死模型。假手术组14只大鼠缝线在LAD下穿过但不结扎,其余步骤同心肌梗死模型制作。10只心梗大鼠在手术后24小时内死亡。存活的56只心肌梗死大鼠随机分为四组：对照组(C组,n=14)、瑞舒伐他汀组(R组,n=14)、小剂量托拉塞米组(T1组,n=14)和大剂量托拉塞米组(T2组,n=14),每天分别给予生理盐水、瑞舒伐他汀(10毫克/千克体重)、托拉塞米(T1：1毫克/千克体重,T2：2毫克/千克体重)灌胃处理4周。假手术组(n=14)术后全部存活,每天给予生理盐水灌胃处理4周。在接下来的4周里,5个组中只有对照组1只大鼠死亡。2.超声心动图检查4周干预期结束时,5组大鼠行经胸超声心动图检查。测量左心房直径(LAD)、左心室舒张末期内径(LVDd)、左心室收缩末期内径(LVDs)、左心室短轴缩短率(LVFS)、左心室射血分数(LVEF)等。3. LVEDP测定超声心动图检查结束时,用2F压力-容积电导导管通过右颈动脉插入到左心室,导管的另一端连接到16通道生理记录仪进行血流动力学检测。测定的LVEDP视为左心房压力。4.样本的采集和处理测定LVEDP后处死大鼠,开胸并分离左心房。取左心房分成两部分,一部分放入10%福尔马林固定,石蜡包埋切片(切片厚约4微米),用于Masson染色和免疫组化染色；另一部分迅速放入液氮中保存,用于Western blot分析。分离的左心室存入液氮备用。5.组织学分析每组大鼠的心房肌切片行Masson染色,染色后用中性树胶封片,显微镜下观察染色结果,蓝色为胶原纤维,红色为肌纤维。胶原容积分数(collagen volume fraction, CVF)是指视野中胶原染色的区域面积占总面积的百分比。每张切片上随机选取8个视野,通过使用ImagePro Plus软件(version 6.0, USA)计算CVF来反映左心房纤维化程度。计算CVF时视野中血管周围区域不记入内。心室切片使用氯化三苯基四氮唑染色后计算梗死面积。6.免疫组化染色切片经二甲苯及梯度酒精脱蜡后,用浓度0.01M、PH7.4的柠檬酸钠抗原修复液对抗原进行修复,经0.3% H2O2甲醇溶液对内源性过氧化酶封闭后,用山羊血清对切片封闭30min,滴加一抗(兔抗大鼠P-p38 MAPK,1:1600 dilution, Cell Signaling Technology, Massachusetts, USA),4℃过夜。冲洗后在室温用二抗(抗兔IgG biotinylated antibody,1:200 dilution, AK 5004, Vectastain, USA)孵育30分钟。然后用ABC复合物在室温孵育切片30分钟,再用3-3-二氨基联苯胺和用作色原的0.005%的H202显色1-3分钟。接下来切片用Harris苏木精复染色2-5分钟,在梯度乙醇和二甲苯中脱水,用封片胶(Entellan neu, Merck, Germany)封片。使用尼康180显微镜观察切片,每张切片上随机选取8个视野计算阳性细胞指数。7. Western blot分析分离的左心房组织冰上匀浆、离心,然后取上清,测定蛋白质浓度。灌胶、样品沸水浴、电泳、转膜,5%脱脂牛奶封闭,一抗孵育、二抗孵育,与增强化学发光试剂反应,分析比较。8.统计学分析使用SPSS 19.0软件,采用单因素方差分析进行统计学分析。研究结果：1.瑞舒伐他汀对心脏功能参数和左心室心肌梗死面积的影响与假手术组比较,4个心肌梗死组(C、R、T1和T2)心脏扩大、收缩功能不全,表现为LAD、LVDd和LVDs增加,而LVEF和LVFS减低。瑞舒伐他汀能增加LVEF和LVFS,表现出了改善左室功能的心脏保护性作用。4个心肌梗死组之间的梗死面积没有显著差异。2.血流动力学评估与假手术组相比,4个心肌梗死组中LVEDP均显著升高。R、T1和T2组中LVEDP与C组相比均明显降低。R与T1组间LVEDP无显著差异(p=0.37)。T2组的LVEDP明显低于R组(P<0.05)。因此,本研究中观察瑞舒伐他汀对心肌梗死后心房结构重构的影响时将T1组作为阳性对照组。3.瑞舒伐他汀对心房纤维化的影响各组大鼠左心房组织经Masson染色后心肌细胞呈红色,胶原纤维呈蓝色。Masson染色的结果表明,心肌梗死后,左心房一部分肌细胞变性和凋亡导致心肌面积缩小,胶原合成增加致胶原面积增大,所以CVF升高,心肌间质纤维化发生。与假手术组相比,4个心肌梗死组(C、R、T1和T2)中的CVF显著升高。与C组相比,R、T1和T2组的CVF明显降低。值得注意的是R组的CVF分别低于T1和T2组,并且具有统计学差异。4.免疫组化分析显示瑞舒伐他汀抑制P-p38 MAPK阳性细胞指数是指视野中阳性细胞占总细胞数量的百分比。在本研究中,P-p38 MAPK阳性细胞的细胞核被染成棕黄色。与假手术组相比,4个MI组(C、R、T1和T2)中的阳性细胞指数明显增加。与C组相比,T1和T2组的P-p38 MAPK阳性细胞指数均显著下降(分别降低20.4%和29.6%),而R组的P-p38 MAPK阳性细胞指数下降更为明显(44.6%)。R和T1、T2组之间的P-p38 MAPK阳性细胞指数均有统计学差异。5. Western blot结果显示瑞舒伐他汀对P-p38 MAPK具有抑制作用。与假手术组相比,4个MI组(C、R、T1和T2)中P-p38 MAPK表达明显增多。R、T1和T2组的P-p38 MAPK的表达相比C组显著下降。R组P-p38MAPK的表达明显低于T1组,但与T2组间比较时无显著差异。结论：1.瑞舒伐他汀(10毫克／千克／天)和低剂量托拉塞米(1毫克／千克／天)在通过灌胃治疗心肌梗死大鼠时,其降低LVEDP的作用无明显差异。2.大鼠心肌梗死后,心房CVF升高,提示发生了心房纤维化即心房的结构重构；而且主要分布于心房肌细胞细胞核的P-p38 MAPK增加,后者很可能与心肌梗死后心房结构重构有关。3.瑞舒伐他汀可抑制心肌梗死大鼠的心房结构重构,其机制可能与瑞舒伐他汀下调P-p38 MAPK有关。意义：本研究为了观察瑞舒伐他汀对心肌梗死后心房结构重构的直接影响,我们在前期实验的基础上采用托拉塞米作为阳性对照药物,来消除瑞舒伐他汀对心肌梗死后心房结构重构的间接影响,结果显示P-p38 MAPK在心肌梗死后心房结构重构中起着重要的作用,瑞舒伐他汀通过抑制p38 MAPK信号途径减轻心肌梗死大鼠的心房结构重构。可能为房性心律失常的早期预防提供了新的思路和靶点。