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昼夜节律是所有生物体内广泛存在的现象,它使各种行为、生化和生理过程与环境因素的变化同步。昼夜节律紊乱的人群患神经退行性疾病的风险显著增加,阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种常见的神经退行性疾病,许多患者发病早期便出现明显的昼夜节律和睡眠紊乱,β-淀粉样蛋白(Amyloidβ-protein,Aβ)作为AD最重要的病理特征之一与疾病发展有关。伴有Aβ斑块形成的三转基因AD模型(3x Tg-AD)小鼠表现出明显的昼夜节律紊乱,然而Aβ本身是否会引起昼夜节律紊乱尚不清楚。针对AD患者出现的昼夜节律紊乱,目前临床上尚无有效的治疗手段。Ⅱ型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)与AD在发病上具有相关性,T2DM的治疗药物——胰高血糖素样肽1(Glucagon like peptide 1,GLP-1)的受体激动剂Exendin-4已被证实可以有效改善AD小鼠学习记忆能力的下降,但是Exendin-4是否可以逆转Aβ所致昼夜节律紊乱尚不清楚。目前Exendin-4发挥神经保护作用多采用有创的侧脑室或海马内给药,鼻腔给药作为神经保护性药物的新型给药方式,近年来被广泛关注。因此,本实验创新性的对Exendin-4采用鼻腔滴液的方式进行给药,通过ELISA实验证实Exendin-4可以到达海马组织,利用小鼠自主跑轮行为学实验观察鼻腔给予Exendin-4明显改善Aβ31-35引起的小鼠昼夜节律紊乱,并且在分子水平通过Real-time PCR证实Exendin-4可部分逆转Aβ31-35所致视交叉上核(Suprachiasmatic Nucleus,SCN)中生物钟基因per1及per2基因表达的改变,旨在为改善AD患者昼夜节律紊乱提供一定的实验基础。第一部分海马内注射Aβ31-35引起C57BL/6小鼠昼夜节律紊乱目的:观察Aβ31-35经海马内注射后对小鼠昼夜节律的影响。方法:通过三维脑立体定位仪分别将高压灭菌三蒸水(Aβ31-35的溶剂)、Aβ31-35注射入海马,设立为Vehicle组及Aβ31-35组;随后将这两组小鼠放入跑轮装置,设置12:12光照——黑暗(Light-Dark,LD)一周后持续黑暗(Constant darkness,DD)两周,通过Vital View数据收集系统及Acti View生物节律分析系统检测两组小鼠跑轮运动的昼夜节律。结果:在LD环境中,两组小鼠均表现出稳定的、接近24 h的昼夜节律,活动期——静止期分界明显。在DD环境下,Vehicle组小鼠的内源性昼夜节律依然存在,睡眠相——运动相分界明显,自由运转周期为:23.54±0.11 h;Aβ31-35组小鼠则表现出较为分散的跑轮运动,其昼夜节律发生明显改变,自由运转周期比Vehicle组明显延长,为23.69±0.06 h(P(27)0.05)。同时,海马内注射Aβ31-35明显降低小鼠的跑轮运动量,为719.3±107.0 counts/h,与Vehicle组(1113.2±133.8 counts/h)相比,差异具有统计学差异(P(27)0.05)。结论:Aβ31-35经海马内注射可以引起C57BL/6小鼠昼夜节律紊乱及运动活性下降。第二部分鼻腔给予Exendin-4可以进入C57BL/6小鼠海马组织目的:观察Exendin-4经鼻腔给药后进入小鼠海马组织的情况。方法:(1)鼻腔给药:保持小鼠清醒状态,一手固定小鼠头部,暴露鼻腔,另一手操作移液枪采用滴液的方式进行给药。(2)鼻腔给予高压灭菌三蒸水(Exendin-4的溶剂)设为Vehicle组;将25 nmol/kg body weight(bw)Exendin-4经鼻腔给予C57BL/6小鼠,利用ELISA实验对给药10 min、30 min及3 h后的小鼠海马组织进行Exendin-4含量检测。(3)分别经鼻腔给予C57BL/6小鼠高压灭菌三蒸水、5 nmol/kg bw Exendin-4、25nmol/kg bw Exendin-4,30 min后提取小鼠海马及大脑皮层组织,采用ELISA实验检测Exendin-4在两个组织中的含量。结果:(1)鼻腔给予25 nmol/kg bw Exendin-4,10 min后小鼠海马组织中Exendin-4含量与Vehicle组相比无明显增加;30 min实验组及3 h实验组Exendin-4在海马组织中的含量水平明显高于Vehicle组(P(27)0.05);但与30 min实验组相比,给药3 h后海马中Exendin-4含量明显降低(P(27)0.05)。(2)与Vehicle组相比,5 nmol/kg bw Exendin-4实验组与25 nmol/kg bw Exendin-4实验组小鼠海马组织中Exendin-4含量明显升高(P(27)0.05),且25 nmol/kg bw实验组中Exendin-4在海马组织的水平高于5 nmol/kg bw实验组(P(27)0.05)。同时Vehicle组、5 nmol/kg bw实验组及25 nmol/kg bw实验组的小鼠大脑皮层中Exendin-4含量无明显差异,且三组的含量均低于海马组织(P(27)0.05)。结论:鼻腔给予Exendin-4可以进入C57BL/6小鼠的海马组织,且进入海马组织的量高于大脑皮层。第三部分鼻腔给予Exendin-4改善Aβ31-35所致C57BL/6小鼠昼夜节律紊乱及可能机制目的:观察鼻腔给予Exendin-4对Aβ31-35所致昼夜节律紊乱的影响及可能机制。方法:Exendin-4鼻腔预处理的方法:25 nmol/kg body weight的Exendin-4经鼻腔给药后计时,2 h后重复给药1次,随后将小鼠麻醉,经海马内注射Aβ31-35;将Vehicle组、Aβ31-35组、Exendin-4预处理组及Exendin-4单独给药组小鼠放入跑轮装置,设置LD一周后DD两周,观察小鼠跑轮运动的昼夜节律;随后根据小鼠在DD环境下昼夜时间(Circadian time,CT),于CT2、CT8、CT14及CT20四个时间点分别提取四组小鼠的SCN,通过Real-time PCR实验检测per1基因及per2基因的变化情况。结果:在DD环境下,Exendin-4鼻腔预处理组小鼠出现较清晰的运动相——休息相,与Aβ31-35组相比,自由运转周期明显缩短,为23.56±0.07 h(P<0.05);同时,鼻腔单独给予Exendin-4并不影响小鼠自身节律,自由运转周期为23.50±0.05 h。Aβ31-35破坏了SCN组织中per1及per2基因表达的节律振荡;Aβ31-35引起小鼠SCN组织中per1基因在CT14的表达量(1.09±0.18)较Vehicle组(1.53±0.35)明显降低(P<0.05);Exendin-4预处理部分纠正了per1基因的异常表达(1.43±0.34);Exendin-4单独给药并不影响SCN中per1基因在4个CT的表达。同时,Aβ31-35引起小鼠SCN组织中per2基因在CT8的表达量(0.99±0.10)降低,与Vehicle组(1.47±0.35)相比差异具有统计学意义(P<0.05);Exendin-4预处理改善了per2基因异常表达,为1.40±0.38;Exendin-4本身不影响per2基因在4个CT的表达。结论:鼻腔给予Exendin-4可以明显改善Aβ31-35所致C57BL/6小鼠昼夜节律紊乱,且有可能是通过调整per1及per2基因的异常表达而实现的。