血友病B是一种凝血因子IX基因缺陷引起的X染色体连锁的出血性疾病。与传统的治疗方法-输血相比，基因治疗的优势在于花费少，没有被感染和形成血栓的危险。本研究采用重组AAV为载体，使凝血因子IX基因在血友病B小鼠体内高效、长期稳定地表达，从而改善小鼠的出血症状，提高各项凝血指标，为今后的临床试验打下了基础。首先，通过rHSV/AAV杂合辅助病毒方法制备出高滴度的重组AAV/mFIX病毒颗粒，并注射到血友病B小鼠的后肢骨骼肌中（2×1012 v.g./只），获得了稳定的高水平小鼠IX因子表达(>370ng/ml)，持续时间超过350天。治疗组小鼠体内的IX因子活性达到正常值的30％，而且出血症状得到显著改善。在小鼠血浆中未发现抗IX因子的中和抗体，第一次注射后抗AAV抗体的水平非常低，重复注射AAV/mFIX病毒后，不同剂量组的小鼠体内的抗AAV抗体出现了不同的结果。组织分析的结果证实了血浆中有功能的FIX因子确实来源于骨骼肌。然后，构建了由CMV启动子、肝细胞特异性启动子和EF基因启动子调控的人凝血因子IX小基因的重组腺相关病毒载体，并通过rHSV/AAV杂合辅助病毒的方法大量制备成重组腺相关病毒颗粒（rAAV/hFIX）。经HPLC方法纯化后，进行QC-PCR测定滴度。将rAAV/hFIX病毒以2.5-3×1011vg/只，分别由尾静脉或直接肌肉途径注射到血友病B小鼠体内中，检测到人IX因子最高表达量达到350（肌肉注射） 和500 （尾静脉） ng/ml血浆，持续表达时间超过12周。血中产生的中和抗体情况与表达曲线相吻合。小鼠血清中可以检测到少量抗HSV抗体和抗AAV抗体。提高病毒剂量到2×1012 v.g./只后，尾静脉注射途径的hFIX表达为4320 ng/ml，但中和抗体的成倍增加使表达时间没有明显延长。治疗组小鼠的出血症状有了明显改善，部分指标甚至超过了正常小鼠的测定值。我们还将Cre-loxP系统引入重组AAV的生产过程之中，用缺陷型腺病毒AdLC作为生产重组AAV的辅助病毒。在大量生产带有目的基因（EGFP、hFIX）的重组腺相关病毒载体的同时，最大限度地限制了辅助病毒的产生（只有对照组的0.3%），从而减轻了下游纯化工作的压力。活体动物试验的结果证实了这种方法的优越性。<WP=5>另外，采用HSV复制子法大量制备携带报告基因EGFP和hFIX基因的重组腺相关病毒载体，且滴度达到109vg/ml。包装出来的AAV都具有感染活性，经离体感染BHK、Vero细胞后，转AAV-hFIX的在上清中检测到较高水平的hFIX表达，而且表达水平还随病毒感染复数（MOI）提高而增加，最高达到754±32 ng/106细胞/24小时；转AAV-EGFP的细胞从36小时后可以观察到荧光，且荧光细胞比例随病毒感染复数（MOI）提高而增加，最多时70％以上细胞发荧光。最后，分别用两种EGFP质粒转染BHK细胞，形成稳定表达的混合克隆后，连续传代10次， BHK细胞荧光比例分别为20.27％和11.08％。这一结果提示我们，在离体条件下，即使没有反式因子的参与，AAV ITR序列的存在仍然对转基因的长期表达有着积极的作用。