研究背景和目的：我国结直肠癌的流行病学特点提示直肠癌尤其是低位直肠癌仍是影响群众健康的重要疾病。其流行病学有着自身的特点：一是发病年龄偏低,我国大肠癌的中位发病年龄大约是45岁,比欧美国家提前12-18年；二是直肠癌特别是中下段直肠癌多见——约70%左右的大肠癌为直肠癌,而70%的直肠癌位于距肛缘8cm以下；三是患者就诊时多属中晚期,极大地影响了治疗效果,5年生存率一直在低水平徘徊。术前新辅助放疗成为中晚期低位直肠癌的重要治疗手段,但其有效性只有70%左右,而目前缺少有效的预测患者放疗敏感性的生物学指标。因此寻找有价值的放疗敏感性预测指标是本研究的重点。术前新辅助放疗业已成为进展期中低位直肠癌治疗的标准方案,寻找预测放疗敏感性的分子标记值得深入研究。近年来,随着欧美几宗大样本随机对照研究的完成,提示进展期直肠癌的辅助放疗更倾向于术前实施。主要理由是：术前肿瘤周围区域血运未被破坏、血供好、氧合程度高,放疗效果确切；且于术前行新辅助放疗后肿瘤降期明显、切缘阴性率高、保肛概率大；术前行辅助放疗对肿瘤的局部控制率优于术后实施；同时,术前实施的不良反应明显低于术后。更有文献报道,术前放疗可提高病人的长期生存率。但是,直肠癌是一种腺癌,其整体对单纯放射治疗不如鳞癌、恶性淋巴瘤等敏感,对放疗有明显效果、部分效果和效果不明显的病人各占约1/3左右,总有效率约为70%,近30%患者从新辅助放疗中获益较少,甚至只增加了治疗毒性反应,反而有延误病情之虞。因此,寻找有关直肠癌放射敏感性的分子标记,更好地对病人进行个性化筛选应是当前研究的重点。许多研究试图找到有关直肠癌放疗敏感性的生物学标志物以更好的对病人进行选择,包括P53和P21等,但在临床上尚难以得到广泛的应用。目前主要的方法还是依据肿瘤的临床特征,包括肿瘤的大小、活动度,肿瘤分化程度以及影像学检查提示的肿瘤分期等进行筛选,而这些临床指标均缺乏与肿瘤放疗敏感的相关性。因而预测放疗敏感性的新型分子标记值得探寻。microRNA几乎参与了肿瘤发生发展的全过程,在外周血和组织中都可稳定存在并可通过现有手段进行相对定量,有望成为肿瘤诊断的新型分子标记。Giuseppina Della Vittoria Scarpati等人选取了38例中晚期地位直肠癌患者的放疗前标本,对标本进行microRNA芯片筛选并用荧光实时定量PCR进行验证,并结合超声内镜对患者放疗前后肿瘤缓解程度的评价,发现hsa-miR-622和hsa-miR-630预测中晚期低位直肠癌放疗敏感与否,其敏感性和特异性都达到100%。经过筛选,我们选择了hsa-miR-622作为研究对象。Hsa-miR-622是由位于染色体13q31.3的基因编码,据PNAS报道,hsa-miR-622与结直肠癌的发生发展有重要关系。研究方法：一、hsa-miR-622在细胞和组织水平的差异表达及其与放疗敏感性的关系1、荧光实时定量PCR检测hsa-miR-622在SW480、HT29、HCT116、LS174.T、 SW837、HR8348细胞中的内源性表达。对SW480、HT29、HCT116、LS174.T、 SW837、HR8348分别给予2、3、4、5Gy的放疗剂量进行处理,利用CCK-8和平板克隆形成实验观测放疗后细胞增殖情况,摸索适合的放疗剂量并对比不同细胞株的放疗敏感性差异。2、分别将六株细胞注射到裸鼠皮下,待其成瘤后,取荷瘤裸鼠肿瘤组织,通过荧光实时定量PCR检测荷瘤裸鼠肿瘤组织中hsa-miR-622的表达。肿瘤最大直径至10mm后,对荷瘤裸鼠按临床治疗剂量进行放疗处理,用游标卡尺记录放疗组和未放疗组肿瘤的大小变化情况。以肿瘤缩减率(未放疗组肿瘤最大直径-放疗组肿瘤最大直径/未放疗组肿瘤最大直径)作为评价肿瘤的放疗敏感性的指标,对比内源性hsa-miR-622的表达与荷瘤裸鼠放疗敏感性的关系。3.收集进展期中低位直肠癌患者的放疗前肿瘤组织活检标本,共17例。荧光实时定量PCR检测17例进展期中低位直肠癌患者放疗前活检标本中hsa-miR-622的表达。根据南方医院病历管理系统中所记录的放疗前后CT、肠镜以及术后病理报告对比患者放疗敏感性的差异,利用Mandard肿瘤缓解程度分级的标准对患者放疗后肿瘤缓解程度进行分级。二、沉默和过表达hsa-miR-622对结直肠癌细胞及荷瘤裸鼠敏感性的影响1.利用细胞瞬时转染实验,选择SW480和HCT116两株细胞进行瞬时转染,其中SW480对hsa-miR-622进行干扰,而HCT116则转入mimics模拟过表达hsa-miR-622,荧光实时定量PCR检测细胞瞬时转染效率。对细胞进行放疗处理,利用PI染色后进行流式细胞实验对比细胞的放疗敏感性变化。通过慢病毒转染技术获得稳定过表达和沉默hsa-miR-622的细胞株,荧光实时定量PCR检测四株细胞慢病毒转染效率,利用细胞增殖实验(CCK-8和平板克隆形成实验)对比在转染慢病毒后细胞放疗敏感性的变化。2、将稳定过表达组、沉默组细胞和N.C组分别注射到裸鼠皮下。待荷瘤裸鼠肿瘤最大直径约10mm左右后,对荷瘤裸鼠按临床治疗剂量进行放疗处理,用游标卡尺记录放疗组和未放疗组肿瘤的大小变化情况。以肿瘤缩减率(未放疗组肿瘤最大直径-放疗组肿瘤最大直径/未放疗组肿瘤最大直径)作为评价肿瘤的放疗敏感性的指标,将对照组和沉默组、对照组和过表达组进行对比。对比荷瘤裸鼠在沉默和过表达hsa-miR-622后放疗敏感性的变化。三、hsa-miR-622的靶基因的预测及表达特性分析1、以hsa-miR-622为检索词,检索microRNA.org、TargetScan两个数据库进行靶基因的预测。将2个数据库的预测结果取交集后,对所得靶基因进行GO分类,同时利用DAVID数据库对分类结果进验证,最后根据microRNA.org数据库对基因作用的注解及评分选取目的靶基因。2、构建预测所得靶基因的3’UTR表达载体以及将hsa-miR-622结合位点突变后的3’UTR的突变载体。在工具细胞293FT中利用双萤光素酶报告系统验证hsa-miR-622是否能够与预测所得基因的3’UTR区相结合并对预测所得靶基因的表达产生抑制,并在直肠癌细胞株SW837中验证。3、western-blot检测裸鼠皮下肿瘤组织内源性及在沉默和过表达后RB1基因的差异表达,对比荷瘤裸鼠放疗敏感性与RB1表达强弱的关系,分析RB1的表达与放疗敏感性的关系。4、免疫组化染色检测中晚期直肠癌患者的放疗前活检石蜡标本中RB1的表达,对比个体间RB1的表达差异与患者放疗敏感性的关系5、western-blot检测直肠癌细胞株HCT116中RB1、E2F1、E2F8三个蛋白在放疗后1-8h的表达情况,探讨三个蛋白间的相互作用。研究结果：一、hsa-miR-622在细胞水平和组织水平的差异表达及其与放疗敏感性的关系1、荧光实时定量PCR检测hsa-miR-622在SW480、HT29、HCT116、LS174.T、 SW837、HR8348细胞中的表达。以Ls174.T细胞的表达为参照组,对结果通过单因素方差分析显示：5种细胞株中hsa-miR-622的表达量之间差异具有显著性(F=118.335,P<0.001)。方差齐性检验显示方差齐性,LSD两两比较后发现：HR8348细胞当中hsa-miR-622的表达量最高,且高于SW480(P<0.001)、 HT29(P<0.001)、HCT116(P<0.001)、SW837(P<0.001)细胞中的表达：hsa-miR-622表达较高的是SW480细胞,且高于HT29(P<0.001)、HCT116(P<0.001)、 SW837(P<0.001)细胞中的表达；hsa-miR-622在HT29中的表达高于HCT116(P=0.032)、SW837(P=0.018)。而hsa-miR-622表达较低的两株细胞之间无统计学差异SW837与HCT116(P=0.741)。hsa-miR-622在HR8348、SW480、 HT29、HCT116、SW837、LS174.T中依次降低。在HR8348、SW480、HT29表达相对较高,在HCT116、SW837、LS174.T表达相对较低,对SW480、HT29、 HCT116、LS174.T、SW837、HR8348分别给予2、3、4、5Gy的放疗剂量进行处理后,CCK-8、平板克隆形成实验以检测细胞放疗敏感性显示SW480、HT29、 HR8348对放疗不敏感,而HCT116、Ls174.T、SW837对放疗敏感。我们发现hsa-miR-622的内源性表达与细胞的放疗敏感性负相关。2、荧光定量PCR检测荷瘤裸鼠肿瘤组织中hsa-miR-622的表达,以Ls174.T为参照组,将其他5个实验组进行单因素方差分析结果显示：五株细胞株在裸鼠皮下成瘤后,检测肿瘤组织hsa-miR-622表达结果有统计学差异(F=315.155P<0.001)。方差齐性检验显示方差不齐,Dunnett T3两两比较后发现：HR8348细胞当中hsa-miR-622的表达量最高,且高于SW480(P=0.011)、HT29(P=0.002). HCT116(P=0.004)、SW837(P=0.003)细胞中的表达；hsa-miR-622表达较高的是SW480细胞,且高于HT29(P=0.066)、HCT116(P=0.022)、SW837(P=0.016)细胞中的表达；hsa-miR-622在HT29中的表达比HCT116(P=0.008)、 SW837(P=0.005)细胞中的表达。而hsa-miR-622表达较低的两株细胞中HCT116的表达要高于SW837(P<0.001)的表达。HR8348、SW480、HT29、HCT116、 LS174.T、SW837在裸鼠皮下成瘤后,肿瘤组织中hsa-miR-622的表达依次降低,在HR8348、SW480、HT29表达相对较高,在HCT116、SW837、LS174.T表达相对较低。对比荷瘤裸鼠在注射不同结直肠癌细胞株的放疗敏感性差异,结果显示：不同细胞株在裸鼠皮下成瘤后,肿瘤组织放疗敏感性有统计学差异(F=6.141P=0.005)。LSD两两比较结果显示,注射HT29细胞的荷瘤裸鼠放疗敏感性要低于HCT116(P=0.002)、Ls174.T (P=0.008)和SW837(P=0.024),与HR8348(P=0.829)和SW480(P=0.984)无统计学差异。注射SW480的荷瘤裸鼠放疗敏感性要低于HCT116(P=0.004)、Ls174.T (P=0.012)和SW837(P=0.036),与HR8348(P=0.845)相比无统计学差异。注射HR8348的荷瘤裸鼠放疗敏感性要低于HCT116(P=0.002)、Ls174.T (P=0.008)和SW837(P=0.025)。HCT116与Ls174.T (P=0.522)、Ls174.T与SW837(P=0.562)、 SW837与HCT116(P=0.233)之间放疗敏感性无统计学差异。我们发现hsa-miR-622在荷瘤裸鼠肿瘤组织中的内源性表达与其放疗敏感性负相关3、收集17例进展期中低位直肠癌患者的放疗前瘤组织标本,检测其中hsa-miR-622的表达。并利用南方医院病历管理系统中记录的CT、肠镜以及术后病理报告,对比临床患者的放疗敏感性差异情况,利用Mandard肿瘤缓解程度分级的标准对患者进行分级。17例标本中,5例患者经过Mandard肿瘤缓解程度分级为TRG4,其hsa-miR-622的表达水平较高,而在相对最低表达的3例患者均达到完全缓解。二、沉默和过表达hsa-miR-622对结直肠癌细胞及荷瘤裸鼠放疗敏感性的影响1、荧光实时定量PCR检测细胞转染效率,对结果进行t检验显示hsa-miR-622在SW480N.C中的表达要高于SW480IN中的表达(t=13.313,P=0.006),结果具有统计学差异而HCT116N.C中的表达要低于HCT116hsa-miR-622中的表达(t=13.313,P=0.008)。说明瞬时转染对hsa-miR-622的表达产生影响。对细胞进行放疗处理,利用PI染色后进行流式细胞实验对比细胞的放疗敏感性变化。发现mimics转染的细胞株与对照组相比,放疗敏感性下降(t=-16.186,P<0.001),而inhibitor转染后的细胞株与对照组相比,放疗敏感性增强(t=-13.556,P<0.001)。荧光实时定量PCR检测四株细胞慢病毒转染效率,采用单样本t检验对结果进行分析,在干扰组中SW480IN的hsa-miR-622的表达与SW480N.C组相比无统计学差异(t=4.285,P=0.050)；而HT29IN的hsa-miR-622表达要高于HT29N.C (t=5.387,P=0.033);在过表达组中HCT116hsa-miR-622的表达与HCT116N.C组相比无统计学差异(t=2.853, P=0.104); SW837hsa-miR-622的表达要高于SW837N.C组的表达(t=5.541,P=0.031)。同时利用细胞增殖实验(CCK-8和平板克隆形成实验)对比在转染慢病毒后细胞放疗敏感性的变化,结果显示：与对照组相比,沉默组细胞株放疗敏感性增强,而在过表达组中,细胞放疗敏感性减弱。2、对荷瘤裸鼠在沉默和过表达hsa-miR-622后放疗敏感性的变化。结果显示：注射SW480IN的荷瘤裸鼠比注射SW480N.C的荷瘤裸鼠的肿瘤缩减率明显(t=5.572,P=0.005)。注射HCT116N.C的荷瘤裸鼠比注射HCT116hsa-miR-622的荷瘤裸鼠的肿瘤缩减率明显(t=3.283,P=0.030)。注射SW837N.C的荷瘤裸鼠比SW837hsa-miR-622的荷瘤裸鼠肿瘤缩减率明显(t=2.917,P=0.043)。三、hsa-miR-622的靶基因预测及表达特性分析1、通过软件预测分析并查阅相关文献,最终得到hsa-miR-622的靶向调控基因RB1。2、在工具细胞293FT中,双荧光素酶报告系统结果显示,在转染克隆有RB1基因3’UTR质粒的实验组中,单因素方差分析结果显示：组间存在统计学差异(F=139.970,P<0.001)。LSD进行两两比较：hsa-miR-622组与blank组相比萤光素酶活性降低(P<0.001),hsa-miR-622组与N.C组相比萤光素酶活性降低(P<0.001)。blank组和N.C组相比荧光素酶活性未见明显变化(P=0.838),说明对照转染序列未对荧光素酶活性产生影响。Hsa-miR-622inhibitor与N.C inhibitor组(P=0.168)和blank组(P=0.231)相比,萤光素酶活性均差异无统计学意义。在转染克隆有MutRB1基因3’UTR质粒的实验组中,单因素方差分析结果显示各组间荧光素酶活性无统计学差异(F=2.397,P=0.120)。证明hsa-miR-622能与RB1基因3’UTR结合,从而抑制了萤光素酶的活性。这以结果也在SW837细胞中得到验证。3、不同细胞在裸鼠皮下成瘤后,western-blot检测肿瘤组织内源性RB1的表达,对比裸鼠放疗敏感性与RB1表达强弱的关系,发现在RB1高表达的组织中,荷瘤裸鼠对放疗更敏感。同时检测注射稳定转染细胞的裸鼠肿瘤组织中的RB1表达,分析其与放疗敏感性的关系。结果显示：发现在转染hsa-miR-622过表达慢病毒的细胞在皮下成瘤后的肿瘤组织中RB1的表达较N.C组降低,而在干扰组中RB1表达升高。在放疗敏感性方面,与N.C组相比,过表达组荷瘤裸鼠放疗敏感性降低,抑制组放疗敏感性增加。4、免疫组化染色检测中晚期直肠癌患者的放疗前活检石蜡标本中RB1的表达,对比个体间RBl的表达情况与患者对放疗敏感性的关系,结果显示RB1在27例患者中均呈强阳性表达,个体间无统计学差异。5、western-blot检测RB1、E2F1、E2F8三个蛋白在放疗后1-8h的直肠癌细胞株中的表达情况。结果显示：三个白蛋白在放疗后1-8h都有先降低再升高最后降低的变化过程。他们之间的关系有待进一步的研究。结论Hsa-miR-622的差异表达结直肠癌细胞的放疗敏感性负相关Hsa-miR-622的差异表达与荷瘤裸鼠放疗敏感性负相关RB1是hsa-miR-622的直接作用靶基因RB1的差异表达与结直肠癌细胞放疗敏感性正相关RB1的差异表达与荷瘤裸鼠放疗敏感性正相关