论文部分内容阅读
木聚糖是最丰富的半纤维素多糖，包裹在纤维素外层，与纤维素和木质素一起构成了“生物质抗降解屏障”。木聚糖的有效降解不仅可以加速木质纤维素资源的生物转化，而且其降解产物及衍生物如木寡糖、木糖醇等都是高附加值产品，因此木聚糖的高效高值降解是利用木质纤维素资源的重要一步。曲霉属丝状真菌的基因组含有大量编码木聚糖同工酶的基因，编码多种木聚糖同工酶，因此曲霉属真菌展示出了强大的木聚糖降解潜力。多组分的木聚糖酶在木质纤维素的降解中是如何发挥作用与功能的目前还不清楚。因此，系统全面地研究木聚糖同工酶的降解模式，了解微生物分泌多个同工酶降解半纤维素的过程，探讨不同木聚糖同工酶的转录调控、作用模式和协同作用的机制，以进一步揭示微生物降解半纤维素的机理，对酶系协同实现高效催化有重要科学意义，也对于指导生产具有实际应用价值。
黑曲霉(Aspergillus niger)An76拥有最完整的木聚糖降解酶系基因，包括4个GH11β-1，4-内切木聚糖酶基因和5个不同家族的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因。本研究以A.nigerAn76为研究对象，结合定量转录、分子生物学、生物化学和结构生物信息学的手段，对其GH11内切木聚糖酶和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶进行了深入系统的研究，取得如下主要研究成果:
1.对黑曲霉同一GH11家族不同β-1，4-内切木聚糖酶组分进行了生理生化生信分析，揭示了不同组分之间对木聚糖降解能力的细微差异。
AspergillusnigerAn76编码4种GH11β-1，4-内切木聚糖酶，定量转录结果表明，其中XynA和XynB在木糖类底物中被上调，但分泌次序和分泌量各不相同，XynA首先被诱导，其次是XynB被诱导，而XynD和XynE始终未见诱导表达。异源表达了GH11家族的四个木聚糖酶组分(XynA、XynB、XynD和XynE)并进行了生化性质表征，结果显示它们都是中温偏酸性酶，最适温度为50℃，最适pH为5.0，其中XynB的比酶活是XynA的8倍。产物谱分析表明XynA偏好降解木六糖，XynB和XynD偏好降解木四糖。对GH11木聚糖酶活性中心进行结构生物信息学分析，结果表明GH11木聚糖酶的不同降解偏好与活性中心的功能残基和底物之间形成的复杂氢键有关。且在降解山毛榉木聚糖时XynA和XynB具有明显的协同作用。结合生理和生化实验，证明A.nigerAn76的多个GH11β-1，4-内切木聚糖酶在降解木聚糖时是有分工的，首先分泌XynA降解大寡糖，然后分泌具有高酶活性的XynB降解小寡糖。该研究结果说明，木聚糖酶多组分之间的这种协同作用是微生物用来促进木聚糖有效降解的一种策略。
2.对黑曲霉不同家族α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶进行了生理生化分析，证明不同家族α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶具有不同底物特异性和降解模式。
在A.nigerAn76的基因组中，存在5个编码阿拉伯呋喃糖苷酶的基因，其编码的阿拉伯呋喃糖苷酶(AxhA、AbfA、AbfB、AbfC、AbfD)分属于GH62(AxhA)、GH51(AbfA、AbfC)、GH54(AbfB)和GH43(AbfD)家族。定量转录结果表明，GH62家族的AxhA和GH54家族的AbfB两个酶组分在各种木糖类底物中均被明显诱导;GH51家族的AbfC在带侧链的木聚糖底物诱导的后期转录量上升。异源表达了AxhA、AbfB、AbfC三个阿拉伯呋喃糖苷酶，其最适温度均为50℃，最适pH也相同，均为pH5.0。底物特异性测定的结果显示，AxhA对主链为木聚糖、侧链为阿拉伯糖基的底物活性最高，而AbfB对主链为阿拉伯聚糖、侧链为阿拉伯糖基的底物活性最高，AbfC对pNP-AraF有明显的特异降解能力。通过对三者降解聚糖的产物谱进行分析，确定了AxhA和AbfB均能断裂α-1，2/α-1，3-糖苷键，释放阿拉伯糖，但AxhA断裂α-1，2/α-1，3连接的糖苷键的效率更高，而AbfB除作用于α-1，2/α-1，3的连键外，还具有水解α-1，5-糖苷键的活性。由此可知，A.nigerAn76通过编码底物特异性及降解偏好不同的阿拉伯呋喃糖苷酶，从而实现半纤维素的有效降解。未来可基于不同的底物结构精确定制降解酶，实现生物质的高效与高值降解与转化。
3.初步完成了AspergillusnigerAn76遗传操作系统构建的实验设计，明确了部分实验条件，为该菌后续进行遗传操作奠定了基础。
以构建AspergillusnigerAn76遗传操作系统为目的，确定了其进行遗传操作的基本条件。首先，确定了制备原生质体的最佳酶组合:1％哈茨木霉来源的裂解酶和0.5％蜗牛酶;确定了A.nigerAn76的抗性选择性标记:草铵膦抗性基因bar，有效抑制浓度为2.0％;确定了5-FOA在A.nigerAn76转化中的使用浓度:2mg/mL。采用同源重组的方法设计了pyrG基因的敲除实验，获得部分重组转化子。通过初步构建的尝试，为实现AspergillusnigerAn76进行遗传操作奠定了技术基础。
黑曲霉(Aspergillus niger)An76拥有最完整的木聚糖降解酶系基因，包括4个GH11β-1，4-内切木聚糖酶基因和5个不同家族的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因。本研究以A.nigerAn76为研究对象，结合定量转录、分子生物学、生物化学和结构生物信息学的手段，对其GH11内切木聚糖酶和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶进行了深入系统的研究，取得如下主要研究成果:
1.对黑曲霉同一GH11家族不同β-1，4-内切木聚糖酶组分进行了生理生化生信分析，揭示了不同组分之间对木聚糖降解能力的细微差异。
AspergillusnigerAn76编码4种GH11β-1，4-内切木聚糖酶，定量转录结果表明，其中XynA和XynB在木糖类底物中被上调，但分泌次序和分泌量各不相同，XynA首先被诱导，其次是XynB被诱导，而XynD和XynE始终未见诱导表达。异源表达了GH11家族的四个木聚糖酶组分(XynA、XynB、XynD和XynE)并进行了生化性质表征，结果显示它们都是中温偏酸性酶，最适温度为50℃，最适pH为5.0，其中XynB的比酶活是XynA的8倍。产物谱分析表明XynA偏好降解木六糖，XynB和XynD偏好降解木四糖。对GH11木聚糖酶活性中心进行结构生物信息学分析，结果表明GH11木聚糖酶的不同降解偏好与活性中心的功能残基和底物之间形成的复杂氢键有关。且在降解山毛榉木聚糖时XynA和XynB具有明显的协同作用。结合生理和生化实验，证明A.nigerAn76的多个GH11β-1，4-内切木聚糖酶在降解木聚糖时是有分工的，首先分泌XynA降解大寡糖，然后分泌具有高酶活性的XynB降解小寡糖。该研究结果说明，木聚糖酶多组分之间的这种协同作用是微生物用来促进木聚糖有效降解的一种策略。
2.对黑曲霉不同家族α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶进行了生理生化分析，证明不同家族α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶具有不同底物特异性和降解模式。
在A.nigerAn76的基因组中，存在5个编码阿拉伯呋喃糖苷酶的基因，其编码的阿拉伯呋喃糖苷酶(AxhA、AbfA、AbfB、AbfC、AbfD)分属于GH62(AxhA)、GH51(AbfA、AbfC)、GH54(AbfB)和GH43(AbfD)家族。定量转录结果表明，GH62家族的AxhA和GH54家族的AbfB两个酶组分在各种木糖类底物中均被明显诱导;GH51家族的AbfC在带侧链的木聚糖底物诱导的后期转录量上升。异源表达了AxhA、AbfB、AbfC三个阿拉伯呋喃糖苷酶，其最适温度均为50℃，最适pH也相同，均为pH5.0。底物特异性测定的结果显示，AxhA对主链为木聚糖、侧链为阿拉伯糖基的底物活性最高，而AbfB对主链为阿拉伯聚糖、侧链为阿拉伯糖基的底物活性最高，AbfC对pNP-AraF有明显的特异降解能力。通过对三者降解聚糖的产物谱进行分析，确定了AxhA和AbfB均能断裂α-1，2/α-1，3-糖苷键，释放阿拉伯糖，但AxhA断裂α-1，2/α-1，3连接的糖苷键的效率更高，而AbfB除作用于α-1，2/α-1，3的连键外，还具有水解α-1，5-糖苷键的活性。由此可知，A.nigerAn76通过编码底物特异性及降解偏好不同的阿拉伯呋喃糖苷酶，从而实现半纤维素的有效降解。未来可基于不同的底物结构精确定制降解酶，实现生物质的高效与高值降解与转化。
3.初步完成了AspergillusnigerAn76遗传操作系统构建的实验设计，明确了部分实验条件，为该菌后续进行遗传操作奠定了基础。
以构建AspergillusnigerAn76遗传操作系统为目的，确定了其进行遗传操作的基本条件。首先，确定了制备原生质体的最佳酶组合:1％哈茨木霉来源的裂解酶和0.5％蜗牛酶;确定了A.nigerAn76的抗性选择性标记:草铵膦抗性基因bar，有效抑制浓度为2.0％;确定了5-FOA在A.nigerAn76转化中的使用浓度:2mg/mL。采用同源重组的方法设计了pyrG基因的敲除实验，获得部分重组转化子。通过初步构建的尝试，为实现AspergillusnigerAn76进行遗传操作奠定了技术基础。