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一氧化氮合成酶(NOS)专一性催化L-精氨酸(L-Arg)转化为L-羟基-精氨酸,然后进一步氧化生成L-胍氨酸和NO,NO再氧化生成稳定的NO2-和NO3-终产物。NO作为重要的细胞信息分子,在神经系统、免疫系统和心血管系统中起着重要的调节作用,NOS作为NO合成的关键酶,其活性变化直接调节NO的生成量及其生物学效应。由于测量低水平NO2-或直接测量NO存在着技术困难,因此对NOS活性的测定是对NO进行深入研究的重要环节。NOS存在着依赖于Ca2+/CaM的原生型NOS(cNOS)和不依赖于Ca2+/CaM的诱导型NOS(iNOS)。为了探讨NMDA受体-NO-cGMP通路在脑缺血损伤中的作用机制,我们利用大鼠全脑缺血模型,应用L-3H-精氨酸转化法测定cNOS和iNOS活性,3H-MK801结合试验测定NMDA受体活性,观察了脑缺血再灌损伤后海马等脑区的NMDA受体、NOS活性和cGMP含量变化。并成功地将大鼠脑NOS的全长cDNA转染NG108-15细胞,筛选到稳定高效表达的克隆细胞株。另外,对猪小脑和大鼠小脑NOS进行了纯化。 第一部分:一氧化氮合成酶的提取、纯化和特性研究。大鼠和牛小脑NOS粗提酶活性存在着时间和剂量依赖性。大鼠小脑NOS底物L-Arg的Km值为1.6μM,Vmax为23.9pmol/mg/min。大鼠小脑NOS是依赖于Ca2+、CaM、NADPH和BH4,其EC50分别为0.55mM、33nM、32.5μM、0.43μM。3—5mM EGTA可以完全抑制大鼠小脑提取液NOS活性;1mM CaM拮抗剂TFP能完全抑制NOS活性,其IC50为12.7μM;NOS抑制剂L-NMA能够竞争性抑制NOS活性,其IC50为1.56μM。 猪小脑经硫酸铵沉淀和DEAE-cellulose层析柱后,再进行2′-5′-ADP agarose亲和层析,其NOS活性为669pmol/mg/min,获得率为2.7%,纯化了4460倍。 大鼠小脑NOS经硫酸铵沉淀和2′-5′-ADP agarose亲和层析后,其NOS活性为688pmol/mg/min,纯化了2646倍,获得率为27%。纯化后的大鼠和