研究背景：阿尔茨海默病(AD)，也称老年性痴呆，是脑神经元退变性疾病，其主要症状是进行性记忆力减退和认知障碍。随着人口老化，AD发病增多，发病机制未明，目前尚无有效的治疗方法，给家庭、社会带来沉重负担。因此，亟需研究寻找有效治疗措施。 近年来，神经干细胞(NSCs)作为中枢神经系统移植、转基因的细胞载体和损伤修复材料，利用神经干细胞进行移植治疗，或通过病毒载体将目的基因导入神经干细胞，为神经系统退行性变和神经损伤的临床治疗带来新的曙光。NSCs能够不断分裂增殖、具有多分化潜能，可以分化成神经元、神经胶质细胞，在体内可以根据不同脑区的微环境分化成该区的神经细胞。这种新的细胞具有以下优点：1．NSCs在脑中能根据其周围微环境的诱导而分裂，分化成相应的细胞类型，其形态和功能与附近的宿主细胞非常类似，因而能部分补偿损伤和死亡细胞的功能；2．中枢神经系统具备特殊的结构——血脑屏障，这使得淋巴细胞在正常情况下很难进入，因此不同个体之间，甚至是不同物种之间的NSCs移植都几乎没有排异反应，大大拓宽了NSCs的来源；3．NSCs可以在体外根据不同的需要导入相应的外源基因，成为一种广谱的细胞载体。 神经营养因子(NTFs)是由靶细胞分泌的一组特异性蛋白分子，有促进和维护神经元生长、存活、分化和执行功能的作用。脑源性神经营养因子(BDNF)是最主要的神经营养因子之一，对周围神经系统和中枢神经系统多种递质神经元具有广谱作用，具有很强的刺激和促进神经细胞生长、分化及促使损伤细胞修复的作用。文献报道给予体外培养的神经前体细胞加入BDNF 主要促其向神经元方向分化。但目前BDNF仍未能在神经系统疾病的临床治疗中应用，因为BDNF是天然的蛋白分子，难以通过血脑屏障，如何把足量的BDNF传送到中枢神经系统损伤的适当部位仍存在困难，而且经常性的脑内注射给药，有导致颅内新的损害或感染的可能。因此，基因转染是目前能提供长期疗效的治疗方法，基因修饰的细胞脑内移植现已成为研究的重点。采用BDNF基因修饰NSCs，不仅可利用它对各种神经元的营养作用，而且可利用它能够促进NSCs主要向神经元方向分化的功能，使NSCs移植脑内后能更大限度地补偿损伤和死亡的神经元，达到缓解和改善AD症状的目的。 目前常用的转基因载体包括一些病毒载体(腺病毒、腺相关病毒等)和阳性脂质体，它们各有不同的特点，目前在转导的细胞中适于作为短时期表达研究。逆转录病毒载体由于其结构和生命周期的原因，并由于已经除去了病毒复制所必须的包装顺序而不能复制，只能借助逆转录病毒包装细胞，能稳定地将外源基因插入和整合到宿丰细胞基因组内，并随细胞分裂而传代，提供了一个高效的、稳定的、长期的目的基因转移手段，适于作为基因转染的载体。 本研究采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法从大鼠海马组织总RNA扩增BDNF基因，构建含BDNF基因的重组逆转录病毒表达载体，将重组体导入神经干细胞，并进行BDNF表达的检测及其生物活性鉴定，为探讨NSCs基因治疗AD动物模型奠定基础。 方法： 1．RT-PCR技术获取BDNF cDNA基因片段根据Gene Bank上大鼠BDNF的cDNA功能全长序列，设计一对引物并导入Hind Ⅲ和BamH Ⅰ限制性内切酶酶切位点。 2．pLEGFP-BDNF重组质粒的构建与鉴定切胶回收阳性条带，用DNA纯化试剂盒纯化，在T4 DNA连接酶作用下，将pMD 18-T simple vector与目的基因片段进行连接，转化入大肠杆菌DH5α感受态细菌中，蓝白斑筛选，按试剂盒说明提取质粒，酶切鉴定，测序得到pMDT-BDNF重组质粒。用BamHⅠ、Hind Ⅲ分别双酶切pMDT-BDNF质粒和逆转录病毒载体pLEGFP-N1，电泳线性片段并予以切胶回收、纯化。 3．BDNF基因修饰神经干细胞的构建及表达复苏逆转录病毒包装细胞PT67，培养于含10％FBS的L-DMED培养基中，至细胞70％-80％汇片，脂质体Lipofectamine 2000介导pLEGFP-BDNF重组质粒转染PT67细胞。转染后48h，用含400ug/ml G418的L-DMEM进行筛选，1W后改用含200ug/ml G418的L-DMEM维持，2W后抗性克隆初步形成。 结论： 1. 构建了脑源性神经营养因子逆转录病毒表达载体pLEGFP-BDNF。 2．构建了BDNF基因修饰的神经干细胞。 3．基因修饰的神经干细胞能表达BDNF且具有良好的生物学活性。