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目的:血管钙化,多年来已被认为是终末期肾脏病患者的一个常见并发症,它是导致终末期肾脏病患者心血管疾病(CVD)发生率及死亡率增加的重要原因。而最近的体外研究显示[1],镁离子可以减轻血管钙化,但潜在机制仍不明确。本课题组前期研究[2]发现高镁可在一定程度上抑制高磷诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)钙化和成骨样转分化,其可能机制是通过降低VSMCs中骨源性相关因子的表达来实现,还有研究发现血管钙化过程与生理骨骼矿化有许多相似之处,是有组织的主动调节过程,涉及许多促进和抑制钙化因素。其中骨形成蛋白(BMPs)在促进血管钙化形成中扮演着重要的角色。而骨形态发生蛋白2(bone morphogenic protein-2,BMP-2)是目前研究最广泛,也是公认的BMP家族中成骨活性最强的亚型[3]。因此,本研究以VSMCs钙化为模型,研究高镁对VSMCs成骨相关因子-骨形成蛋白2(BMP-2)表达的影响。方法:1实验方法及分组1.1体外VSMCs实验选择4周龄健康雄性SD大鼠80g-100g(购自河北医科大学动物实验中心),运用组织块贴壁法原代培养SD大鼠胸主动脉VSMCs。将VSMCs随机分为4组,即正常对照组、高磷组、高镁组和镁通道抑制剂干预组(2-APB干预组)。(1)正常对照组:加入10%胎牛血清的DMEM培养;(2)高磷组:正常培基中加入10m Mβ-甘油磷酸;(3)高镁组:高磷培基中加入3m M硫酸镁(Mg SO4);(4)2-APB干预组:高磷培基中加入3m M硫酸镁及10-4m M 2-APB。1.2血管环实验选择1只6周龄健康雄性SD大鼠240-260 g(购自河北医科大学动物实验中心),无菌条件下取出胸主动脉,将血管切成2mm-3 mm长的血管环。将血管环随机分为4组(n=5):正常对照组、高磷组、高镁组、镁通道抑制剂(2-APB)干预组。各组培养基同细胞培养。将剩余2只大鼠按照上述方法体外培养血管环,重复2次。2通过茜素红钙化染色检测VSMCs钙化情况:结果判断标准:钙盐沉积处为橘红色。细胞钙含量测定:BCA法测定细胞蛋白含量,结果用蛋白含量校准钙含量(mg/g蛋白)。细胞ALP活性由酶联免疫吸附法来检测,结果用蛋白质校准。运用RT-PCR和Western-blot方法检测各组细胞中BMP-2及Runx2的表达。3通过von Kossa钙化染色检测血管环钙化情况,钙盐沉积处为棕黑色。钙含量测定:邻甲酚酞络合酮比色法检测血管环钙含量情况。应用免疫组织化学方法检测血管环BMP-2及Runx2的表达。4数据分析符合正态分布的计量资料采用均数±标准差(sx±)表示,采用SPSS 17.0统计学软件进行分析,多组间均数的比较采用单因素方差分析(ANOVA),组间两两比较用SNK检验(Student-Newman-Keuls)。P<0.05为差异有统计学意义。结果:1高镁环境对高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化和血管环钙化的影响1.1高镁环境对高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化的影响:细胞培养14天后,茜素红染色及钙含量结果均显示,与正常对照组比较,高磷组及镁通道抑制剂干预组细胞钙盐沉积明显增多(P<0.05);与高磷组比较,高镁组细胞钙盐沉积减少(P<0.05);与高镁组相比,镁通道抑制剂组细胞钙盐沉积增多(P<0.05)。1.2高镁环境对高磷诱导的大鼠胸主动脉血管环钙化的影响:血管环培养14天后,von Kossa染色结果显示,高磷组及镁通道抑制剂干预组大鼠胸主动脉血管环中膜可见不同程度棕黑色钙盐沉积,但对照组、高镁组大鼠胸主动脉血管环均未发现棕黑色钙盐沉积;与高镁组比较,高磷组大鼠胸主动脉血管环中膜棕黑色钙盐沉积明显增加。钙含量测定结果基本与硝酸银染色结果一致。2高镁环境对高磷诱导的血管平滑肌细胞BMP-2、Runx2表达及ALP活性表达的影响RT-PCR及Western-blot结果显示保持一致,与正常对照组相比,高磷组细胞BMP-2、Runx2表达明显增加(P<0.05);与高磷组相比,高镁组细胞BMP-2、Runx2表达明显减少(P<0.05);与高镁组相比,镁通道抑制剂干预组细胞BMP-2、Runx2表达增加(P<0.05)。ALP活性测定结果显示:高镁环境抑制了ALP的活性(P<0.05)。3高镁环境对高磷诱导的大鼠胸主动脉血管环BMP-2、Runx2表达的影响免疫组织化学结果显示,与正常对照组和高镁组比较,高磷组和镁通道抑制剂干预组大鼠BMP-2、Runx2表达增加(P<0.05);与高磷组比较,高镁组大鼠BMP-2、Runx2表达明显降低(P<0.05);与高镁组相比,镁通道抑制剂干预组大鼠BMP-2、Runx2表达增加(P<0.05)。结论:高镁环境可以抑制高磷诱导的大鼠血管环钙化的发生,其机制可能是通过调节BMP-2及Runx2的表达,进而影响了血管平滑肌细胞成骨/成软骨样表型转化来实现的。