研究背景 镇痛药广泛应用于各种恶性肿瘤，特别是手术后和晚期肿瘤病人的麻醉及疼痛治疗，因此，在临床上常与抗肿瘤药同时使用。但是，至今为止有关镇痛药对抗肿瘤药物疗效影响的研究报道很少。顺铂作为临床上常用的广谱化疗药，对睾丸癌、卵巢癌、肺癌和头颈部癌等实体瘤都有很好的疗效，是多种肿瘤化疗方案中的组成药物。使用顺铂进行化疗的肿瘤病人，在用镇痛药进行麻醉及镇痛时，是否对其疗效产生影响，尚未见报道。 目前对镇痛药的作用机制较多集中于神经突触及其相关离子通道的研究，而对镇痛药影响细胞信号转导机制的作用及意义缺乏深入的研究和了解。有研究表明，镇痛药对细胞缝隙连接(gap junction，GJ)介导的细胞问通讯(gapjunctional intercellular communication，GJIC) 的影响可能是其镇痛作用机制之一。 GJ 是细胞之间的一种蛋白质连接通道，广泛存在于实质性脏器(如心脏，肝脏，肾脏，中枢神经，皮肤，肌肉等)组织中，由特殊的通道蛋白——连接蛋白(connexin，Cx)组成。6个Cx环绕在一起组成一个“半通道”(hemichannel，又称为连接子connexon)。两个位于各自细胞胞膜上的“半通道”对接在一起形成一个GJ。GJ沟通相邻细胞的胞浆，细胞浆中分子量<1 kDa的物质(如离子，细胞信号分子和代谢物质等)可通过GJ扩散、转运到与其毗邻的细胞浆。GJ提供了一种细胞与细胞之间的直接联系通道，是细胞之间信号传递的一种重要方式。现已证明GJ在同步细胞的活动、维持细胞内环境稳定、控制细胞的生长和发育等生命过程中发挥十分重要的作用；GJ异常与许多疾病(包括肿瘤)的发生、发展有密切的关系。最近有报道：在培养的正常细胞和肿瘤细胞，GJ能够增强多种化学毒物引起细胞凋亡的作用。特别指出的是，GJ可增强抗肿瘤药物顺铂的细胞毒性。尽管有许多研究探讨了镇痛药对GJIC的影响，但结果并不一致；并且目前的研究只注重GJ与镇痛药镇痛机制的关系，对镇痛药能否通过改变GJIC而影响抗肿瘤药(如顺铂)的细胞毒性还未见报道。本研究拟观察不同化学结构的镇痛药(吗啡、曲马多和凯纷)对转染并稳定表达Cx32的Hela细胞GJIC的作用；在此基础上，进一步了解上述镇痛药对顺铂细胞毒性的影响，以及这种影响是否是通过改变GJ功能而产生的。 研究目的： 了解镇痛药对GJ功能和顺铂细胞毒性的影响；并探讨镇痛药改变GJ功能的作用与其对顺铂细胞毒性影响的关系。为阐明镇痛药的作用机制和顺铂耐药性产生的机理提供资料；为指导肿瘤化疗病人合理使用镇痛药提供理论基础。 实验方法： 转染并表达含Cx32的Hela细胞的培养、筛选及诱导：本实验室构建了一系列能够表达同质性Cx (homomeric，由同一种Cx组成的通道)或异质性Cx(heteromeric，由不同Cx组成的通道)的载体质粒。这种双向质粒可以在一个肩动子的控制下同时表达任意一种或两种Cx。Cx的表达是可以控制的，一般情况下，Cx不表达；需要表达时，先用含G-418、潮霉素的培养基筛选细胞，然后在培养基中加入doxycycline引起Cx表达。这样，能够避免因过度表达Cx引起的细胞伤害。 镇痛药对培养细胞GJ功能影响测定：将表达有Cx32的HeLa细胞与荧光指示剂Calcine-AM和DiI-CM共同孵育，使Calcine-AM和DiI-CM进入细胞。培养4小时，待形成稳定的GJ后，用显微荧光系统观察，计数一个“供体细胞”周围含有calcine的“接受细胞”作为GJ功能指标。 镇痛药对顺铂细胞毒性的影响测定：本研究采用Dr．Glazer报道的“标准细胞集落形成分析法”，测定顺铂对培养细胞(稳定表达Cx32的HeLa细胞)的细胞集落(克隆)形成的影响。细胞集落形成反映了单个细胞的增殖潜力，能较灵敏地测定抗癌药的活性。本实验以顺铂降低细胞集落形成率(SurvivingFraction)作为顺铂的细胞毒性指标。用不同密度接种细胞的方法获得有GJ形成(已融合)的细胞和无GJ形成(未融合)的细胞。在上述细胞，观察GJ形成对顺铂的细胞毒性影响。细胞集落形成率(Surviving Fraction)=顺铂处理组的细胞集落数/未用顺铂处理组的细胞集落数为了避免不同生长期的细胞对顺铂敏感性的差异对实验结果的影响，细胞在加入顺铂前24小时用无血清培养基培养，使所有细胞均同步在G1期。 实验结果： 1．吗啡(10μg/ml)对表达Cx32的Hela细胞GJ功能无影响。而曲马多和凯纷(1μg/ml，10μg/ml)对上述细胞的 GJ 功能有显著的抑制作用(P<0.05)，凯纷的抑制作用强于曲马多和2-APB(2.3μg/ml)。 2．顺铂(0.5μg/ml)能够显著降低表达Cx32的HeLa细胞集落形成率。在有GJ形成的细胞(高密度接种，生长融合的细胞)，顺铂的细胞毒性显著大于无GJ形成细胞(低密度接种，细胞生长未融合)。在有GJ的细胞，用2-APB(2.3μg/ml)抑制GJ，可降低顺铂的细胞毒性。结果证明GJ能增强顺铂的细胞毒性；抑制GJ可使顺铂的细胞毒性降低。 3．曲马多(10μg/ml)无细胞毒性。曲马多和顺铂联合使用，在有GJ形成的细胞，细胞集落形成率显著高于顺铂单用组；表明曲马多能降低顺铂的细胞毒性。而在无GJ形成细胞，曲马多并不能改变顺铂的细胞毒性。结果表明曲马多可降低顺铂的细胞毒性；曲马多对顺铂细胞毒性的影响是通过GJ产生的。 4．在有或无GJ形成的细胞，凯纷(10μg/ml)都降低细胞集落形成率，表明凯纷有一定的细胞毒性。在有GJ形成的细胞，凯纷和顺铂联合使用组的细胞集落形成率显著高于顺铂单用组；表明凯纷能降低顺铂的细胞毒性。而在无GJ形成细胞，凯纷对顺铂的细胞毒性无影响。结果表明凯纷可降低顺铂的细胞毒性；凯纷对顺铂细胞毒性的影响是通过GJ产生的影响。 结论：1．曲马多和凯纷均抑制由Cx32组成的细胞缝隙连接功能，吗啡对其无影。2．曲马多和凯纷均能够通过抑制GJ功能而减弱顺铂的细胞毒性作用。3．凯纷有较弱的细胞毒性作用。