目的:牙髓干细胞（human dental pulp stem cells,h DPSCs）是骨组织工程常用的种子细胞,本实验旨在探究褪黑素对h DPSCs增殖及成骨分化的影响及相关调控机制。材料与方法:（1）通过组织块贴壁法提取h DPSCs;采用流式细胞术检测其表面抗原,并结合成骨、成脂双向分化能力的验证以对细胞进行鉴定。（2）将获得的h DPSCs置于含不同浓度（0,1μM,5μM,10μM,25μM,50μM,100μM,250μM,500μM,1000μM）褪黑素的完全培养基中培养后,通过CCK-8（Cell counting kit-8）实验、划痕实验以初步分析不同浓度褪黑素对h DPSCs增殖和迁移的影响,并进一步明确后续成骨诱导实验中褪黑素的适当浓度梯度。（3）将细胞分别使用完全培养基、成骨诱导培养基（osteogenesis induce medium,OIM）、OIM+1μM褪黑素、OIM+10μM褪黑素、OIM+100μM褪黑素、OIM+500μM褪黑素培养。通过碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）染色和活性检测、茜素红染色及钙结节测定、RT-q PCR分析成骨相关基因以及Western Blot分析成骨相关蛋白表达水平,明确褪黑素对h DPSCs成骨分化的影响。（4）通过转录组测序（RNA sequencing,RNA-Seq）筛选在褪黑素促h DPSCs成骨分化过程可能参与的信号通路,加入该通路抑制剂进一步结合Western Blot及成骨早晚期表型检测以阐明参与褪黑素促进h DPSCs成骨分化过程的潜在分子机制。结果:（1）本实验从患者口内完整拔除的正畸减数牙或健康第三磨牙牙髓中成功分离出h DPSCs,并通过流式细胞术检测出h DPSCs表面CD90及CD44阳性和CD34、CD45的阴性表达。成骨诱导14 d后,经茜素红染色可在镜下观察到钙结节的存在;成脂诱导3周后油红O染色显微镜观察可见脂滴形成。结果证实本实验可从健康牙髓中成功提取具备多向分化能力的h DPSCs。（2）CCK-8结果显示,当褪黑素浓度达到500μM以上时,与细胞共培养后三个时间点均可观察到h DPSCs显著抑制的增殖能力。而褪黑素浓度在100μM和250μM时,h DPSCs的增殖能力则显著上调。划痕实验进一步证实100μM的褪黑素促进h DPSCs迁移的效果最佳。（3）在成骨诱导过程中RT-q PCR结果表明,在不同浓度条件的组别中,100μM的褪黑素所诱导的h DPSCs产生最为显著的成骨相关基因上调趋势。进一步的Western Blot结果显示,几种成骨相关蛋白的表达水平均在褪黑素的干预下上调,且褪黑素浓度为100μM时各类蛋白表达水平最高。ALP活性检测和茜素红染色发现,在一定浓度褪黑素的干预下,h DPSCs的ALP活性、钙盐沉积情况均有不同程度提高,其中在100μM浓度条件下褪黑素展现出最为理想的早期和晚期成骨表型。（4）RNA-Seq的生物信息学分析结果表明,多个差异基因被富集到了MAPK、PI3K/AKT等成骨相关信号通路上。加入PI3K通路抑制剂LY294002,p-AKT蛋白表达水平被抑制,碱性磷酸酶活性和茜素红染色结果表明褪黑素对h DPSCs早期和晚期成骨的促进作用也被抑制。结论:在100μM浓度条件下,褪黑素可有效提升h DPSCs的增殖和迁移能力,并可显著促进h DPSCs的成骨分化;褪黑素促进h DPSCs的成骨分化过程与PI3K/AKT信号通路相关。