论文部分内容阅读
【目的】 腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）被称为真核生物"细胞能量调节器"，能够调节能量代谢、细胞增殖及凋亡等过程。糖尿病肾病（DN）是糖尿病常见而严重的并发症，细胞外基质沉积是其最主要发病机制之一。本文中将通过体内、外实验来探讨糖尿病肾病中AMPK活性改变及其对糖尿病肾病的保护作用，并进行相关信号通路的研究。 【方法】 1．24只雄性 Wistar大鼠随机分为糖尿病组（n=16）和普通饮食组（n=8），糖尿病组以高糖高脂饮食加小剂量链脲佐菌素（STZ）诱导糖尿病模型，8周后再将其随机分为两组，分别经尾静脉导入表达持续激活型AMPKα1的重组腺相关病毒 rAAV2-AMPKα1312-CA（AMPKα1312，T172D）和作为对照的rAAV2-GFP。观察12周后处死实验大鼠，留取肾脏组织。PAS染色观察比较各组大鼠肾脏的病理改变，免疫组化染色检测各组肾脏组织Ⅳ胶原蛋白α1（Col4α1）的表达，Western blot法检测Col4α1、AMPKα1及磷酸化AMPKα1、磷酸化的乙酰辅酶A羧化酶（p-ACC）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、磷酸化的mTOR及其下游分子磷酸化水平。 2．采用30mM葡萄糖刺激大鼠正常肾成纤维细胞株（NRK-49f），在不同时间点观察高糖对细胞外基质蛋白Col4α1表达、AMPK及mTOR信号通路活性的影响；然后用表达持续激活型 AMPKα1的重组腺相关病毒 rAAV2-AMPKα1312-CA（AMPKα1312，T172D）、表达抑制型AMPKα1的r-AAV2-AMPKα1-DN（AMPKα1，D157A）和rAAV2-GFP分别感染NRK-49f细胞，Western blot法检测各组细胞Col4α1表达、AMPK及mTOR信号通路分子磷酸化水平；最后，将细胞随机分为5组：正常糖浓度组、高糖组、高糖+雷帕霉素（rapamycin）组、高糖+r-AAV2-AMPKα1-DN组、高糖+r-AAV2-AMPKα1-DN+rapamycin组，Western blot法检测各组mTOR磷酸化及Col4α1表达水平。 【结果】 1．动物实验中，我们发现，与正常组大鼠（C组）相比，感染rAAV2-GFP的糖尿病大鼠（GFP组）肾脏内AMPK和ACC磷酸化水平显著降低；与GFP组相比，感染rAAV2-AMPKα1312-CA的糖尿病大鼠（CA组）肾脏内ACC磷酸化水平显著升高，肾脏/体重，肾小球体积，肾小球系膜基质增生等指标有明显改善，细胞外基质Col4α1表达及mTOR信号通路中各分子磷酸化水平显著降低。 2．高糖刺激可诱导肾成纤维细胞表达Col4α1，引起AMPK和mTOR信号通路活性改变且具有时间依赖性。引入表达持续激活型 AMPKα1的rAAV2-AMPKα1312-CA（AMPKα1312，T172D）后能够明显抑制基质蛋白Col4α1的合成和mTOR信号通路活性；相反，表达抑制型AMPKα1的r-AAV2-AMPKα1-DN（AMPKα1，D157A）能够上调基质蛋白合成和mTOR信号通路活性，后者又可被mTOR抑制剂rapamycin抑制。 【结论】 1．rAAV2介导的截断突变型 AMPKα1（AMPKα1312，T172D）基因治疗可能通过增加糖尿病大鼠肾脏AMPK活性，抑制mTOR信号通路，缓解基质沉积，对糖尿病大鼠肾脏起保护作用。 2．AMPK可能通过mTOR信号通路抑制肾成纤维细胞基质蛋白的合成。