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第一部分缺氧状态下HIF-1α对慢性髓细胞白血病细胞增殖作用的研究目的本实验通过采集慢性髓细胞白血病病人骨髓标本和健康志愿者骨髓标本,检测HIF-1α的表达水平,了解病人骨髓中HIF-1αm RNA表达水平与健康志愿者间的差异。并尝试分析HIF-1α基因对慢性髓细胞白血病细胞增殖作用的影响和可能的作用机制。方法通过实时定量RT-PCR方法检测慢性髓细胞白血病病人和相对正常病人骨髓标本中HIF-1α的m RNA表达水平差异。通过RT-PCR法确认K562细胞系中HIF-1α被Si RNA沉默。通过CCK-8法测定沉默HIF-1α后的K562细胞系的增殖和集落形成能力。通过RT-PCR法检测沉默HIF-1α后的K562细胞系中p21、p53的m RNA水平,通过westernblot法检测沉默HIF-1α后的K562细胞系中p21、p53蛋白的表达水平。结果1慢性髓细胞白血病病人骨髓中HIF-1αm RNA的表达水平显著高于对照组,存在显著的统计学意义(P<0.05)。2沉默K562细胞中的HIF-1α能显著抑制K562细胞系的增殖能力,存在显著的统计学意义(P<0.05)。3沉默K562细胞中的HIF-1α能显著抑制K562细胞系的集落形成能力,存在显著的统计学意义(P<0.05)。4通过沉默K562细胞系的HIF-1α基因,该细胞系中p21的m RNA和蛋白表达被显著抑制,而p53的m RNA和蛋白表达未受影响。结论1慢性髓细胞白血病病人骨髓中HIF-1α的表达水平显著高于正常人。2 HIF-1α通过上调p21的表达可以促进慢性髓细胞白血病细胞的增殖。第二部分缺氧状态下VEGF对慢性髓细胞白血病细胞增殖作用的研究目的探讨慢性髓细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)患者血清中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达水平及其对细胞增殖的影响。方法采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)定量检测12例CML患者(7例慢性期,5例急变期)血清VEGF水平,体外高、低表达VEGF,利用RT-PCR法检测VEGF转染K562细胞后VEGF m RNA水平,并观察转染后对K562细胞增殖的影响。结果1血清VEGF在慢性髓细胞白血病患者组中的水平为115.8±32.72(ng/L),正常对照组的水平为391.95±91.21(ng/L),差异有统计学意义(P<0.05)。上述结果表明VEGF在CML患者组中表达较高。2检测慢性髓细胞白血病不同临床分期患者的血清VEGF水平,慢性髓细胞白血病慢性期患者的血清VEGF水平为267.4±58.89(ng/L),慢性髓细胞白血病急变期患者的血清VEGF水平为473±51.12(ng/L)。结果显示慢性髓细胞白血病慢性期VEGF水平显著低于急变期患者,差异有统计学意义(P<0.05)。3与对照组相比,K562细胞转染反义核苷酸后,VEGF m RNA水平显著降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。同时反义核苷酸转染入K562细胞后,随着培养时间的延长,细胞增殖速度与对照组相比明显减慢,差异具有统计学意义(P<0.05),而转染正义核苷酸组,细胞生长速度与对照组比,无显著性差异。提示了低表达VEGF表达水平可以抑制K562细胞的增殖。4在转染反义核苷酸组的细胞中加入外源性的VEGF165后,能部分抵消反义核苷酸抑制K562细胞生长的作用,差异有统计学意义(P<0.05)。进一步提示VEGF对细胞增殖具有促进作用。结论1 VEGF能促进慢性髓细胞白血病细胞系K562细胞的增殖。2 VEGF能帮助监测慢性髓细胞白血病的疗效并预测预后。第三部分T315I突变的慢性髓细胞白血病协同治疗的策略目的设计LBH589+ATO、LBH589+17-AAG、17-AAG+ATO、LBH589+Vx-680四个实验组,将这四组药物两两联合分析其对Ba/F3-P210-T315I的治疗效果并分析它们与单药相比的协同效应。方法采用CCK-8法检测LBH589、ATO、17-AAG、Vx-680单药及LBH589+ATO、LBH589+17-AAG、17-AAG+ATO、LBH589+Vx-680四组联合用药对Ba/F3-P210-T315I、Ba/F3-P210细胞系的增殖抑制作用。通过流式细胞术应用AnnexinⅤ-PI试剂盒检测单药及联合用药对Ba/F3-P210-T315I、Ba/F3-P210细胞系的促凋亡作用。通过westernblot法检测LBH589作用于Ba/F3-P210-T315I细胞系后Aurora激酶的表达水平。结果1 LBH589,ATO,17-AAG,Vx-680单独使用对Ba/F3-P210-T315I细胞均有增殖抑制效应,但是Vx-680的增殖抑制效应最为明显,且抑制率随着药物浓度的增加成指数增长,ATO次之。但四种药物的IC50浓度不同,分别为:LBH589(12 nmol/L),ATO(260 nmol/L),17-AAG(80 nmol/L),Vx-680(48 nmol/L)。2四种药物对Ba/F3-P210细胞也具有增殖抑制效应,但是Vx-680的抑制效率最为明显,且四种药物的IC50浓度也不同,分别为:LBH589(24 nmol/L),ATO(480nmol/L),17-AAG(60 nmol/L),Vx-680(32 nmol/L)。3 LBH589+ATO、LBH589+17-AAG、17-AAG+ATO、LBH589+Vx-680四组联合用药对Ba/F3-P210-T315I细胞系的增殖抑制作用为随着IC50浓度的增加,不同的药物组合体现了不同的抑制效率,其中LBH589+Vx-680的组合增殖抑制作用最佳。4通过Annexin V-PI试剂盒染色及流式细胞仪分析发现,LBH589+Vx-680的促凋亡效率最为明显,余次为LBH589+ATO>ATO+17-AAG>LBH589+17-AAG。5 IC50浓度的LBH589作用于Ba/F3-P210-T315I细胞后Aurora A激酶的表达显著减少,而Aurora B激酶的表达无明显变化。结论1 LBH589、ATO、17-AAG、Vx-680单独使用对Ba/F3-P210-T315I、Ba/F3-P210细胞均有增殖抑制效应。2 LBH589+ATO、LBH589+17-AAG、17-AAG+ATO、LBH589+Vx-680四组联合用药中,LBH589+Vx-680对Ba/F3-P210-T315I细胞的增殖抑制和促凋亡效应最好。3 LBH589+Vx-680对Ba/F3-P210-T315I细胞的增殖抑制和促凋亡效应可能是通过抑制Aurora A激酶实现的。