芽胞@胶体金微球用于检测猪胸膜肺炎放线杆菌感染血清中ApxIVA抗体

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猪传染性胸膜肺炎(PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(APP)引起的一种严重猪呼吸系统接触性传染病,给世界范围内的养猪业造成了巨大的经济损失。因此,该病的有效检测对疫情的防控和发现有重要的意义。ApxIV毒素是可以被APP的15种血清型菌株在体内分泌的毒素蛋白,所以基于ApxIVA抗体的检测已成为诊断猪是否感染APP的重要方法。悬浮芯片技术(SAT)是20世纪末发展起来的一种多元化分析技术,综合运用了激光技术、流式细胞技术和生物信息技术,因其检测快速、操作简单、准确性好及高通量等特点,已成为一种具有影响力的对蛋白质、核酸等生物分子进行大规模分析的平台。  本实验以解淀粉芽胞杆菌的芽胞作为固相微球载体,用超声方法和化学试剂对芽胞进行处理之后,使其表面光滑、性质均一。然后将胶体金纳米颗粒吸附在芽胞表面,制备芽胞@胶体金功能微球。通过对微球进行TEM、XRD、XPS、FTIR等电镜和光谱学技术表征后,发现胶体金纳米颗粒的吸附与芽胞表面蛋白的巯基、羧基和氨基基团的相互作用有关。将制备的功能微球用于检测感染APP血清中ApxIVA抗体,复合微球首先固定ApxIVA抗原,然后孵育待检测血清,再依次与生物素-IgG和Cy5-链霉亲和素反应。利用抗原与抗体及生物素与链霉亲和素的特异性结合,将荧光素Cy5标记在微球的表面,完成对悬浮微球的荧光编码。通过相关条件的优化后,用本方法制备的功能微球在检测中具有良好的线性、重复性和灵敏度。在160-10240倍稀释的标准阳性血清中R2=0.9956,11组重复实验中相对标准偏差为4.1%,检测限为20480倍稀释的标准阳性血清,远远低于传统的ELISA方法(S/N=3)。此外,用本方法与商用ApxIVA—ELISA试剂盒共同分析了54份临床猪血清,比较其结果发现,本方法的敏感度为92.6%,符合率为88.9%,特异性为85.2%。由此表明,本实验构建的芽胞@胶体金微球,有作为悬浮芯片用于免疫分析检测中的巨大潜力和应用前景。
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