两种新型酶联免疫分析法超灵敏检测单核增生李斯特菌和大肠杆菌O157:H7

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酶联免疫分析技术(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)是基于免疫酶技术发展的一种非放射性免疫标记分析技术,其中基于辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)催化底物产生显色信号的常规ELISA方法检测灵敏度相对较低,而基于新型信号输出的高灵敏ELISA是当前分析化学领域的研究热点。食源性致病菌是一种以肉制品、蛋制品、水产品、果蔬及乳制品等生鲜食品为传播媒介,随食物摄入人体或动物消化道后释放致病因子引起中毒的致病性细菌。食源性致病菌造成的食品污染问题已成为食品安全的主要问题之一,因食源性致病菌引起的食源性疾病占食品中毒事件的30%-90%。因此,建立简单、快速且灵敏的食源性致病菌特异性检测方法对于控制食源性致病菌污染具有重要意义。本研究探讨了基于过氧化氢酶(Catalase,CAT)介导的两种新型ELISA提高单核增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,L.monocytogenes)和大肠杆菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7,E.coli O157:H7)检测灵敏度的可行性及理论依据。首先研究了基于CAT介导的金纳米粒子可控生长的表面等离子共振ELISA(Plasmonic ELISA,pELISA)建立了超灵敏检测L.monocytogenes的新方法。该研究以二氧化硅(Silicon dioxide,SiO2)纳米颗粒为载体,通过可逆加成-断裂链转移自由基聚合方法在SiO2纳米颗粒表面修饰聚丙烯酸分子刷(PAA),以此作为CAT的“集装箱”提高酶的载量,通过生物素(Biotin)-链霉亲和素(Streptavidin,SA)系统将SiO2@PAA@CAT复合物引入ELISA。当检测体系中存在L.monocytogenes时,双氧水被消耗,氯金酸被还原形成粒径不规则的纳米粒子,溶液呈蓝色;当检测体系中不存在L.monocytogenes时,足量的双氧水还原氯金酸形成规则的球形金纳米粒子,溶液呈红色。依据该原理,建立了检测L.monocytogenes的曲线回归方程:y=-0.015 Log(x)-0.2057(R2=0.985),定量检测范围为8×100CFU/mL至8×106CFU/mL。检测PBS(0.01M,p H7.4)中L.monocytogenes的最低检测限(LOD)为8×101CFU/mL,较传统的ELISA提高了5个数量级。当L.monocytogenes加标浓度分别为8×100、8×101、8×102和8×103CFU/g时,该方法的回收率分别为50±12.5%、101%±22.6%、68.3%±6.13%和76.8%±21.8%;当加标浓度为8×100CFU/g,将1mL稀释液等分成10等份全部用pELISA检测,p ELISA的检测结果和平板计数的结果都表明部分检测结果为阳性,表明该方法可以检测生菜样本中单个L.monocytogenes。且通过特异性评价表明该方法有良好的特异性。其次,基于CAT介导巯基丙酸修饰的碲化镉量子点(MPA-QDs)荧光淬灭的原理建立了高灵敏检测E.coli O157:H7的新方法。通过SA-biotin体系将CAT引入ELISA,当检测体系中存在E.coli O157:H7时,CAT消耗双氧水,MPA-QDs的荧光淬灭率减少。通过优化抗E.coli O157:H7多克隆抗体、生物素化抗E.coli O157:H7单克隆抗体、SA标记的CAT以及H2O2用量,CAT水解H2O2的温度和时间及H2O2和MPA-QDs孵育时间等实验参数,建立了定量检测E.coli O157:H7的三参数逻辑回归曲线方程y=-56.2206+5.1263×Ln(x+6.95×104)(R2=0.9925),定量检测范围为5×102CFU/mL至5×106CFU/mL。检测PBS中E.coli O157:H7的LOD为5×102CFU/mL,比传统ELISA提高了140倍。该方法批内和批间平均回收率分别在84.6%-111.2%和71.6%-108.4%之间,变异系数分别在6.7%-24.9%和6.2%-20.1%之间。牛奶中的加标回收率在65.88%-105.6%之间,变异系数在4.5%-25.7%之间。同时,通过特异性评价表明该方法有良好的特异性。
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