研究背景乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,据资料统计,其发病率占全身各种恶性肿瘤的7-10%,在女性一生中患乳腺癌的可能性约为10%,是女性目前发病率最高的恶性肿瘤。它的发病常与遗传有关,以40—60岁之间、绝经期前后的妇女发病率较高。癌变通常发生在乳房腺上皮组织,是一种严重影响妇女身心健康甚至危及生命的最常见的恶性肿瘤之一。从发展趋势来看,20世纪以来乳腺癌的发病率在全世界各国均是上升趋势。流行病学调查发现,中国妇女发病的高峰年龄较美国提前10年,发病年龄提前这一特点无疑将对社会及家庭造成更大的危害。现在治疗乳腺癌的方法由以往单一的手术治疗模式转向以手术为主,放疗、化疗、内分泌治疗相结合的综合治疗模式。随着对肿瘤治疗的研究进展,一种全新的生物治疗模式成为治疗乳腺癌的选择方式之一。乳腺癌的生物治疗进展表明其相对于传统治疗模式的优越性,大大提高了乳腺癌患者的5年生存率；而近年来分子靶向药物索拉非尼的出现更为乳腺癌患者带来了福音。索拉非尼(Sorafenib)是首个口服的多激酶抑制剂,靶向作用于肿瘤细胞和肿瘤血管上的丝氨酸／苏氨酸激酶和受体酪氨酸激酶,是一种多靶点抗肿瘤药,它对C-RAF、野生型和突变型B-RAF有强效的抑制作用,能抑制C-RAF和B-RAF的丝氨酸／苏氨酸激酶活性；它还能抑制血管内皮生长因子受体-2(vascular endothelial growth factor receptor-2, VEGFR-2)血管内皮生长因子-3(VEGFR-3)以及血小板源性生长因子受体-β(platelet-derived growth factor receptor,PDGFR-β)、FLT3、Ret和c-KIT的酪氨酸激酶的活性,具有双重抗肿瘤活性,主要用于晚期肾细胞癌的治疗。在乳腺癌方面,Bianchi等进行的Ⅱ期多中心非对照临床研究表明索拉非尼400mg单药,每天两次治疗转移性乳腺癌,对总生存率没有明显改善,但该研究显示在使用过一次或多次化疗之后的乳腺癌患者身上再使用索拉非尼可以得到令人鼓舞的疾病稳定率。因此探讨索拉非尼与化疗联合的生物化疗模式成为治疗乳腺癌的新的热点。表阿霉素直接嵌入DNA碱基对之间,干扰转录过程,阻止mRNA的形成,从而抑制DNA和RNA的合成。此外,表阿霉素对拓朴异构酶Ⅱ也有抑制作用。表阿霉素为一细胞周期非特异性药物,对多种移植性肿瘤均有效。日本乳腺癌协会的科学研究小组的一项研究表明对免疫组化染色后定义为TOP2A阳性和BRCA1阴性的患者给予术前含表阿霉素的化疗方案可以得到更高的病理学完全缓解率。本研究意在探讨索拉非尼联合表阿霉素的生物化疗模式对乳腺癌MCF-7细胞的联合抑制作用,并探讨其可能机制,为乳腺癌的综合治疗提供理论基础。研究目的1.了解乳腺癌MCF-7细胞的生长趋势,绘制生长曲线2.了解乳腺癌MCF-7细胞的克隆增值比率,计算克隆形成率3.了解单药索拉非尼对MCF-7细胞的生长抑制作用4.了解单药表阿霉素对MCF-7细胞的生长抑制作用5.了解索拉非尼与表阿霉素单药及联合对MCF-7细胞的生长、凋亡、周期的作用研究方法1.了解乳腺癌MCF-7细胞的生长趋势,绘制生长曲线①人乳腺癌细胞MCF-7在含10%小牛血清的RPMI-1640培养基中培养,3-5天传代一次,取对数生长期细胞作为实验用。②取生长良好的MCF-7细胞以1×104／每孔接种于96孔板,每组3个复孔,分14组,于培养的1～14d每天用MTT比色法检测3个复孔的吸光度值A,取平均值,以时间为横坐标,每日吸光度平均值A值为纵坐标绘制细胞的生长曲线。2了解乳腺癌MCF-7细胞的克隆增值比率,计算克隆形成率①人乳腺癌细胞MCF-7在含10%小牛血清的RPMI-1640培养基中培养,3-5天传代一次,取对数生长期细胞作为实验用。②取生长良好的MCF-7细胞,计数,调整细胞浓度按300个／孔的浓度接种于6孔板中,设3个复孔,置于CO2培养箱中培养。③于14 d时取出观察,细胞已形成克隆,弃培养液。常规固定、姬姆萨染色,清洗,计数>50个细胞的克隆数。克隆形成率(%)=(克隆数／接种细胞数)×100%。3.了解单药索拉非尼对MCF-7细胞的生长抑制的作用①人乳腺癌细胞MCF-7在含10%小牛血清的RPMI-1640培养基中培养,3-5天传代一次,取对数生长期细胞作为实验用。②采用MTT法分析MCF-7细胞对索拉非尼敏感性：靶细胞均以1×104／ml浓度接种于96孔培养板,100μl／孔,培养过夜后,加入药物,索拉非尼设7个浓度梯度,分别为20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125μmol/L,每种药物浓度设4个复孔,实验重复3次,并设不含药物对照组。分别培养24、48、72 h后,每孔加入20μl MTT溶液,继续培养4 h,每孔加入二甲基亚砜150μl,震荡器上充分混匀,于自动酶标仪490 nm波长下测定A值,计算细胞增殖抑制率。抑制率(%)=(对照组A值-实验组A值)／对照组A值×100%,计算50%细胞生长抑制所需的索拉非尼药物浓度(IC50),确定下一步实验药物孵育浓度。4了解单药表阿霉素对MCF-7细胞的生长抑制的作用①人乳腺癌细胞MCF-7在含10%小牛血清的RPMI-1640培养基中培养,3-5天传代一次,取对数生长期细胞作为实验用。②采用MTT法分析MCF-7细胞对表阿霉素药物敏感性：靶细胞均以1×104／ml浓度接种于96孔培养板,100μl／孔,培养过夜后,加入药物,表阿霉素设8个浓度梯度,分别为20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625μmol/L,每种药物浓度设4个复孔,实验重复3次,并设不含药物对照组。分别培养24、48、72h后,每孔加入20μl MTT溶液,继续培养4h,每孔加入二甲基亚砜150μl,震荡器上充分混匀,于自动酶标仪490 nm波长下测定A值,计算细胞增殖抑制率。抑制率(%)=(对照组A值-实验组A值)／对照组A值×100%,计算50%细胞生长抑制所需的表阿霉素药物浓度(IC50),确定下一步实验药物孵育浓度。5了解索拉非尼与表阿霉素联合对MCF-7细胞的生长、凋亡、周期的作用①人乳腺癌细胞MCF-7在含10%小牛血清的RPMI-1640培养基中培养,3-5天传代一次,取对数生长期细胞作为实验用。②根据索拉非尼及表阿霉素单药IC50值制定联合给药浓度。根据索拉非尼单药及表阿霉素单药不同时间点作用的IC50值确定以下实验的作用时间为72h.本实验索拉非尼单药给药浓度定为2、1、0.5μmol／L,表阿霉素单药给药浓度定为1、0.5、0.25μmol／ml,联合组合浓度交互组合定为(2+1)、(2+0.5)、(2+0.25)、(1+1)、(1+0.5)、(1+0.25)、(0.5+1)、(0.5+0.5)、(0.5+0.25)μmol/L每种药物浓度设3个复孔,实验重复3次,并设不含药物对照组。分别培养72 h后,每孔加入20μl MTT溶液,继续培养4 h,每孔加入二甲基亚砜150μl,震荡器上充分混匀,于自动酶标仪490 nm波长下测定A值,计算细胞增殖抑制率。抑制率(%)=(对照组A值-实验组A值)／对照组A值×100%,金正均法判断两药合用是否具有协同作用。q值的计算公式：q=EAB／(EA+EB-EAEB)式中EA和EB为各药单用抑制率,EAB为两药合用抑制率。q>1.15为协同作用,0.85≤q≤1.15为相加作用,q<0.85为拮抗作用。③根据上述实验所得结果取q>1.15的联合组即索拉非尼2μmol/L+表阿霉素0.5μmol/L浓度进行细胞周期及凋亡检测和分析。人乳腺癌细胞MCF-7在含10%小牛血清的RPMI-1640培养基中培养,3-5天传代一次,取对数生长期细胞作为实验用。细胞分为4组,索拉非尼单药组2μmol/L,表阿霉素单药组0.25μmol/L,联合组(2.0+0.25)μmol/L,加药后培养72h,Annexin V-FITC/PI双染法、流式细胞仪检测细胞凋亡情况,PI单染法、流式细胞仪进行细胞周期检测和分析。实验重复3次。6统计学方法实验结果以均数±标准差(x±s)表示,应用SPSS13.0软件进行统计学处理。若只有一种影响因素则采用单因素方差分析(one-way ANOVA)；两种因素以上采用析因分析,有交互效应时进行多重比较,无交互效应时,每种因素可采用单因素方差分析；多重比较采用LSD和SNK法。方差不齐时采用近似F检验(Welch方法)及多重比较的Dunnett’s T3方法。P<0.05(双侧)表示差异有显著性。研究结果1乳腺癌MCF-7细胞的生长趋势,绘制生长曲线MTT法测吸光度值绘制细胞生长曲线可见MCF-7细胞生长初期第4d进入对数生长期,生长速度较快,第8d之后细胞逐渐减慢,生长开始进入平台期,10 d后细胞生长趋于停滞。2乳腺癌MCF-7细胞的克隆增值比率,计算克隆形成率平板克隆形成实验显示14 d后3个孔形成的克隆数分别为102、104、129个／孔,克隆形成率为37.2%。3单药索拉非尼对MCF-7细胞的生长抑制作用经MTT法检测显示,不同浓度索拉非尼对人乳腺癌细胞均有抑制作用,随浓度增高及时间延长抑制率增强(P<0.05),由拟合曲线计算得出索拉非尼单药IC50值,24h为4.58μmol/L、48h为3.46μmol/L、72h为1.82μmol/L。4单药表阿霉素对MCF-7细胞的生长抑制作用经MTT法检测显示,不同浓度表阿霉素对人乳腺癌细胞均有抑制作用,随浓度增高及时间延长抑制率增强(P<0.05),由拟合曲线计算得出表阿霉素单药IC50值,24h为1.53μmol／L、48h为1.52μmol／L、72h为0.99μmol／L。5索拉非尼与表阿霉素单药及联合对MCF-7细胞的生长、凋亡、周期的作用①索拉非尼与表阿霉素单药及联合对MCF-7细胞的生长抑制作用经MTT法检测提示,各浓度单独和联合应用对细胞的抑制率有显著性差异,(P<0.05),各个浓度交互联合组与对应浓度单药索拉非尼组及单药表阿霉素组相比,抑制率均有显著性差异(P<0.05),联合组疗效优于单药组(P<0.05)。②索拉非尼和表阿霉素不同浓度交互联合作用的q值给药后72h检测抑制率结果用金正均发计算q值显示,索拉非尼2μmol/L和表阿霉素0.25μmol/L联合用药组q值为1.19,表现为协同作用；索拉非尼0.5μmol/L和表阿霉素0.25μmol/L联合用药组q值为0.77,未现实相加作用；其余交互联合组均显示相加作用(0.85≤q≤1.15)。③索拉非尼、表阿霉素单药及联合用药对人乳腺癌MCF-7细胞周期的影响流式细胞仪检测细胞周期结果显示,与对照组相比,索拉非尼及表阿霉素单药作用均可使细胞周期阻滞于G0／G1期(P<0.05),联合用药组G0／G1期细胞比率高于索拉非尼及表阿霉素单药组(P<0.05)；但索拉非尼单药及联合组相对于对照组并没有显示对细胞周期S期的阻滞(P<0.05),表阿霉素单药相对于对照组使细胞S期比率下降(P<0.05),联合组相对索拉非尼及表阿霉素未显示对细胞周期S期阻滞(P<0.05)。④索拉非尼、表阿霉素单药合用药对人乳腺癌MCF-7细胞的凋亡作用索拉非尼或表阿霉素单药作用后经流式细胞仪检测,细胞凋亡率较对照组升高(P<0.05)。与索拉非尼(13.3%)和表阿霉素(6.27%)单药组比,联合用药组凋亡率升高更为明显,达23.4%(P<0.05)。结论1.索拉非尼及表阿霉素单药对人乳腺癌MCF-7细胞都有增殖抑制作用。2.索拉非尼与表阿霉素联用具有疗效相加作用。3.索拉非尼和表阿霉素单药或联合能诱导细胞周期阻滞及凋亡,以联合时更显著。