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研究背景和目的:全球80%的鼻咽癌发生在中国,其中以中国华南地区最为高发,而鼻咽癌患者就诊时60%~70%已是局部区域晚期。放射治疗是无远处转移鼻咽癌首选和主要的治疗方法。单纯放疗对早期鼻咽癌有良好的控制,但对局部区域晚期鼻咽癌的治疗尚不足够,有较高的复发及转移率。射线诱导靶细胞产生复杂的信号网,有研究表明射线可以诱导血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)和表皮生长因子受体(EGFR)的激活。这些激活可以导致复杂的细胞保护效应,包括加速细胞增殖,减少细胞凋亡及增强DNA修复。而ZD6474为口服的小分子酪氨酸激酶抑制剂,它同时靶向VEGFR2和EGFR,目前处于Ⅲ期临床试验阶段。
本研究探讨ZD6474联合射线抗鼻咽肿瘤生长和转移的作用及机制。
材料和方法:采用Western blot分析三株鼻咽癌细胞HONE1、5-8F和CNE2中VEGFR2和EGFR的表达及ZD6474与射线之间相互作用的分子机制。MTT法检测ZD6474对鼻咽癌细胞活力的影响,然后选择合适的ZD6474浓度与射线联合进行细胞生长曲线、集落形成、凋亡检测实验评估ZD6474与射线联合在体外的抗鼻咽肿瘤效应。接下来进行鼻咽癌细胞侵袭和迁移的检测评价ZD6474与射线联合抗鼻咽肿瘤转移的效果。最后行体内实验,先在裸鼠身上建立鼻咽癌移植瘤模型,然后分析移植瘤的体积大小、瘤重、裸鼠的生存寿命,把移植瘤用石蜡包埋进行PCNA、TUNEL、CD31的免疫组化分析。
结果:MTT检测的结果显示,ZD6474作用于细胞72小时,细胞增殖抑制的IC50值则分别为4.88μM、4.04μM、3.61μM。我们选用IC40浓度的ZD6474与射线联合进行抗鼻咽肿瘤生长研究,选用IC50浓度的ZD6474与射线联合进行抗鼻咽肿瘤侵袭和迁移研究。因为经过预实验发现ZD6474这些浓度的药物与射线的协同效应最显著。在细胞生长曲线实验中,ZD6474在48小时和72小时均协同增强射线对细胞活力的抑制,以72小时的协同效应最为显著。我们进一步用集落形成实验检测ZD6474及射线对鼻咽癌细胞潜在性的杀伤作用。ZD6474对射线的放射增强比(RER)在HONE-1、5-8F、CNE—2这三株细胞分别是1.61、1.41、1.28。Annexin—V/7-AAD双染检测显示ZD6474和射线诱导凋亡有很强的交互效应(HONE1,p=0.007;5-8F,p=0.016;CNE2,p=0.016)。鼻咽癌细胞侵袭、迁移检测结果显示,射线既不抑制鼻咽癌细胞的侵袭,也不抑制鼻咽癌细胞的迁移(p>0.05)。但是ZD6474显著抑制鼻咽癌细胞的侵袭和迁移(p<0.05),和射线联合作用后,表现出协同抑制鼻咽癌细胞的侵袭和迁移效应(p<0.05)。Western blot检测到射线激活鼻咽癌细胞EGFR以及其下游的AKT,并上调了Rad51和Bcl—2的表达。ZD6474明显抑制了射线诱导的EGFR、AKT的磷酸化表达,减少了Bcl—2、Rad51的表达。在体内抑制鼻咽肿瘤组织生长实验中,ZD6474和射线联合组与对照组、单独ZD6474组或单独射线组比较(t检验),都具有统计学意义(p<0.05),析因分析显示两者有协同的抑制肿瘤生长作用。相应的在ZD6474和射线联合组中观察到的裸鼠寿命是最长的(p<0.05)。免疫组织化学分析表明,联合治疗在体内肿瘤组织也有助于抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞原位凋亡。我们还观察到ZD6474单独或联合射线都能抑制肿瘤微血管的生成。
结论:①射线诱导鼻咽癌细胞株EGFR及其下游通路的活化,ZD6474对射线激活的这条促生存信号通路起到了抑制作用。②ZD6474在体内体外都协同地增强射线抗鼻咽肿瘤效应,而且裸鼠可以耐受这种联合方式。③ZD6474在体外显著性抑制鼻咽癌细胞的侵袭和迁移,并协同地增强射线抑制鼻咽癌细胞侵袭和迁移。