酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH, EC1.14.16.2)是一种以四氢生物喋呤和亚铁离子为辅因子，L-酪氨酸为底物，催化氧化L-酪氨酸形成多巴的芳香族氨基酸羟化酶。该反应是儿茶酚胺类及其衍生物生物合成的第一步也是整个过程中的限速步骤。L-多巴是机体合成多巴胺、黑素及肾上腺素等生物活性物质的前体物质，多巴在一系列酶的作用下转化为儿茶酚类及其衍生物，并且参与到鞣化与免疫黑化中。酪氨酸羟化酶广泛存在于人类、哺乳动物和昆虫中，是新陈代谢不可缺少的酶类。因此研究酪氨酸羟化酶的结构、功能及其稳定性具有十分重要的意义。本研究以家蚕性腺为材料，克隆家蚕（Bombyx mori）酪氨酸羟化酶基因（BmTH）的开放阅读框架，并进行生物信息学分析，构建表达载体转化大肠杆菌BL-21（DE3），表达重组蛋白并经亲和层析纯化。在此基础上，我们进一步分析了家蚕酪氨酸羟化酶的基本酶学性质、酶的动力学参数、底物结合能力、点突变对其功能、结构及其稳定性的变化。本实验的研究内容及结果如下：　　1.家蚕酪氨酸羟化酶（BmTH）基因的克隆、诱导表达及鉴定：利用RT-PCR和 PCR技术将 BmTH编码区克隆到表达载体 pET28a(+)中，转化大肠杆菌 BL21（DE3）进行IPTG和温度诱导表达分析，结果表明1mM IPTG诱导在16℃菌体表达活性蛋白量最大。跑SDS-PAGE以及Western-blot分析表明获得的酶蛋白大小约为63.4kD。为进一步研究BmTH体外酶学性质及相关功能等方面的研究打下基础。　　2.重组家蚕酪氨酸羟化酶的酶学性质：利用酶标仪分析测定了分离纯化得到的酪氨酸羟化酶酶活性及其动力学参数。这些参数包括 KmTyr、KmBH4、Kcat和Vmax分别为26.3±4.8μmol／L、51.9±5.5μmol／L、4.7 S-1和4.7±0.6μmol.min-1，我们也得到酶最适PH在6.8和最适温度28~37℃。　　3.家蚕酪氨酸羟化酶重要氨基酸分析：利用定点突变技术获得酪氨酸羟化酶的突变型用于研究它们与底物酪氨酸、四氢生物蝶呤和亚铁离子之间的结合能力及其对酶活性影响。突变型 BmTH-H394Q和 BmTH-E434A对于亚铁离子的激活作用降低，突变型BmTH-Y429E、BmTH-AA-和BmTH-E434A的KmBH4显著升高，突变型 BmTH-AA-的 KmTyr显著升高，然而其他突变型都未发生明显变化。说明His394和Glu434是亚铁离子相关的氨基酸位点，Tyr429和Glu434是四氢生物蝶呤相关的氨基酸位点，酪氨酸羟化酶N-末端调节区对酶结构和活性都有很大影响。　　4.酪氨酸羟化酶的重要氨基酸突变对其活性、空间结构及稳定性的影响：突变型BmTH-H394Q、BmTH-Y429E、BmTH-E434A和BmTH-AA-的酶活性都显著的降低，而突变型BmTH-D419G的酶活性无明显变化。His394、Tyr429、Glu434和N-AA-的突变和缺失引起了酶的空间结构的变化导致酶活性降低和疏水区的更多暴露，突变后它们结构的稳定性降低，且在高温条件下易于聚沉。并研究了酶的去折叠和再折叠过程，熔球态到活性酶的折叠过程存在俩个中间体，在盐酸胍浓度为0.4 mol/L和1 mol/L时各存在一个蛋白质中间体。以上结果说明His394， Glu434，Tyr429和N-末端调节区是家蚕酪氨酸羟化酶不可或缺的基团。