论文部分内容阅读
目的:脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是后果非常严重的脊柱疾病,它导致神经元死亡、功能性运动和感觉丧失,常会引起损伤平面以下躯体感觉与功能的严重障碍,丧失生活自理能力。目前,临床上尚无有效的治疗方法。随着社会的进步和科学家不懈的探索,外源性干细胞移植可能为脊髓损伤的治疗带来曙光,而由于骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cell,BMSCs)来源广泛,分离培养方法简单,有望成为细胞治疗的“种子”。然而在实验研究中,因为BMSCs移植在宿主体内的成活及转化问题,其进一步应用中无法得到开展。mi RNA广泛存在于生物体内,具有调控真核生物基因表达、个体发育和细胞周期等作用。研究发现,mi RNAlet-7b可以调控神经干细胞的分化、促进干细胞的自我更新等。但是mi RNAlet-7b修饰的BMSCs移植治疗大鼠脊髓损伤的疗效,是否比单纯的BMSCs移植更好,鲜少有研究报道。本实验通过Basso Beattie Bresnahan(BBB)评分评估实验过程大鼠的运动功能,HE染色观察损伤部位脊髓组织的形态学变化,免疫组化SP法观察神经元特异性烯醇化酶(Neurun specific etlolase,NSE)、微管相关蛋白(Microtubule associated proteins-1β,MAP-1β)、波形蛋白(Vimentin,VIM)的表达,Rt-PCR检测脊髓损伤区NGF m RNA的表达情况,进一步研究mi RNAlet-7b修饰BMSCs移植对大鼠损伤脊髓结构和功能的影响,探讨其可能的作用机制。方法:分离培养BMSCs并构建mi RNA-let7b慢病毒载体。按照随机数字表法选取60只健康雌性SD大鼠分为3组:对照组、BMSCs组、mi RNA组,每组20只。采用改良Allen’s法建立实验模型。脊髓损伤后1周,mi RNA组大鼠移植10μL mi RNA-let7b慢病毒载体感染的BMSCs(细胞浓度为10^7/ml),BMSCs组移植等量阴性慢病毒载体转染的BMSCs,对照组给予损伤部位等量生理盐水。分别在脊髓损伤后的第1、2、4、8周对大鼠后肢进行BBB(Basso-Beattie-Bresnahan)评分,评价脊髓损伤后大鼠下肢运动功能的恢复情况。于脊髓损伤后第4周,HE染色观察损伤部位脊髓组织的形态学变化,免疫组化法检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白(MAP-1β)、波形蛋白(VIM)的表达、Rt-PCR法检测脊髓损伤区NGF m RNA的表达情况。实验数据均用SPSS15.0软件进行统计分析,各组间比较采用单因素方差(ANOVA)分析。如果方差齐,组间比较采用t检验;不齐,则采用Tamhane’s T2检验,检验水准α=0.05。结果:1、BBB评分结果:建模3天前评分均为21分,建模成功后评分均低于8分,结果比较差异无统计学意义;1周后3组大鼠出现双下肢运动功能不同程度的改善,不同时间点各组大鼠BBB评分由低到高依次为对照组、BMSCs组、mi RNA组,差异具有统计学意义(P<0.05)。2、HE染色结果:3组大鼠脊髓组织可见结构紊乱充血,神经细胞水肿,对照组结构病理学改变严重,mi RNA组和BMSCs组较轻。3、免疫组化结果:3组脊髓损伤标本均见NSE、MAP-1β、VIM阳性表达。半定量分析法显示神经特异性标志物NSE、MAP-1β、VIM在mi RNA组表现为阳性细胞的数目较多、包浆呈栋褐色,阳性表达明显高于其他各组,差异具有显著意义。干细胞移植组阳性表达高于对照组(P<0.05),组间差异均有统计学意义(P<0.05)。4、PCR结果显示:脊髓组织中NGF m RNA表达水平由低到高依次为对照组、BMSCs组、mi RNA组,且各组间差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:1、mi RNA Let-7b修饰的BMSCs可促进损伤脊髓NSE、MAP-1β、VIM的表达,并促进脊髓损伤后大鼠神经功能的恢复,效果优于单纯干细胞移植组。2、mi RNA let-7b修饰的骨髓间充质干细胞可改善大鼠损伤脊髓的病理改变。