黄曲霉毒素B1(AFB1)、乙型肝炎病毒(HBV)感染、高脂饮食、肠道微生物群、遗传因素均会导致肝细胞脂质蓄积。乙肝病毒x蛋白(HBx)是HBV的四个组成蛋白之一,会引起肝脏脂质蓄积。有研究表明AFB1或HBx暴露可引起人和动物肝脏脂质蓄积,但两者联合暴露诱导的线粒体COX-2依赖性死亡模式和调控机制尚未被阐明。坏死性凋亡是细胞程序性死亡的一种形式,坏死性凋亡复合物形成是其启动的标志。坏死性凋亡在肝脏损伤和疾病过程中起重要作用,抑制坏死性凋亡可以减少酒精诱导的肝脏脂质蓄积。线粒体动态是影响肝细胞脂质蓄积的重要分子事件之一。受体相互作用蛋白激酶(RIP)1和RIP3形成的坏死性凋亡复合物会定位到线粒体上,RIP3与磷酸甘油酸变位酶家族蛋白5(PGAM5)相互作用,导致线粒体分裂增加、融合减少。线粒体融合蛋白2(Mfn2)促进线粒体脂肪酸代谢,从而减缓脂质蓄积。脂肪酸通过肉碱棕榈酰转移酶1A(CPT1A)进入线粒体进行脂肪酸β氧化、胆固醇通过类固醇激素合成急性调控蛋白(StAR)进入线粒体代谢为细胞提供能量,CPT1A与StAR降低会导致肝细胞脂质蓄积。而在HBx表达联合AFB1暴露诱导肝细胞脂质蓄积过程中,线粒体动态的改变模式以及线粒体相关靶分子分布对脂质蓄积的调节作用尚有待阐明。环氧合酶2(COX-2)在绝大部分生理状态下不表达,而在常见的环境污染物、病毒感染等外界刺激时可被诱导,其是一种可调节肝细胞脂质蓄积的蛋白分子。本课题组研究发现HBx表达联合AFB1暴露可诱导肝细胞COX-2表达升高并发生线粒体转位,参与线粒体质量控制(MQC)和动态变化;提示线粒体COX-2与诱导的肝细胞毒性和脂质蓄积及其介导肝脏毒性损伤的关系、以及坏死性凋亡参与的调控机制仍有待进一步研究。目的:本研究旨在探讨HBx表达联合AFB1暴露经由坏死性凋亡诱导肝细胞脂质蓄积的联合毒性作用,以及探明COX-2诱导表达的线粒体转位与RIP3之间的交互作用、及其经由线粒体β氧化介导脂质代谢和坏死性凋亡调控通路的分子机制。结果将为外源环境因素联合暴露诱导肝细胞线粒体依赖性死亡模式调节肝脏脂质代谢紊乱和相关疾病的靶向干预提供潜在靶点和防治策略的依据。方法:(1)体外试验:本研究中采用的三种不同层面HBx表达的肝细胞包括:人肝癌HepG2细胞株,可以稳定进行HBV基因组复制(含HBx表达)的HepG2.2.15细胞;带有Tet-ON开关(可受DOX诱导表达)的HepG2-Tet-ON-HBx细胞;具有代谢酶活性的人肝祖细胞系HepaRG细胞、及其采用DMSO诱导的分化细胞。给予上述细胞分组处理和检测如下:①采用HepG2和HepG2.2.15细胞,给予溶剂(DMSO)和AFB1(1μmol/L)处理48 h或72 h;分别作为HepG2的对照组(Ctrl)和HepG2的AFB1暴露组、以及HepG2.2.15的对照组(即HBV蛋白表达组,含HBx表达)和HepG2.2.15的AFB1暴露组(即HBV+AFB1组)。②采用HepG2-Tet-ON-HBx细胞,给予DOX(1 μg/mL)预处理诱导HBx表达,给予溶剂(DMSO)和AFB1(1μmol/L)处理48 h或72 h,分为对照组(Ctrl)、AFB1暴露组、HBx表达组(DOX+DMSO)和HBx表达联合AFB1暴露组(HBx+AFB1)。③采用HepaRG细胞经DMSO诱导分化28天,实时定量PCR(qRT-PCR)检测分化HepaRG细胞中肝功能相关基因(HNF4A、ALB)、代谢相关基因(NR1I2、RXR、CYP1A2、CYP3A4、GSTM1)等 mRNA 水平。采用 pcDNA3.1-HBx 或对照质粒(1 μg/mL)转染12 h,给予AFB1(0.5 μmol/L)处理48 h或72 h;分为对照组(Ctrl)、AFB1暴露组、HBx表达组(pHBx+DMSO)和HBx表达联合AFB1暴露组(pHBx+AFB1)。④上述各组肝细胞于各自处理48 h时,采用qRT-PCR检测PPARA、PPARG、PTGS2、ACTB等mRNA水平;采用蛋白免疫印迹(WB)检测坏死性凋亡相关蛋白(RIP1、RIP3、p-MLKL)、线粒体动态相关蛋白(Drpl、p-DrplSer616、Mfn2)、以及COX-2等表达水平。⑤上述各组肝细胞于各自处理72 h时,采用油红O染色观察细胞内脂滴分布并进行半定量分析,TC酶法检测细胞中总胆固醇(TC)含量,TG酶法检测细胞中总甘油三酯(TG)含量。⑥上述各组肝细胞,分别给予RIP1抑制剂Nec-1(15 μmol/L)预处理对照组(Ctrl)、HBx表达联合AFB1暴露组(HBx+AFB1组)细胞12h,采用NTT 比色法检测细胞活力。⑦坏死性凋亡干预模型采用Nec-1(15μmol/L)、NSA(1 mmol/L)预处理HepaRG细胞的对照组(Ctrl)、HBx表达联合AFB1暴露组(pHBx+AFB1)12h,采用WB检测线粒体脂质代谢相关蛋白(CPT1A、StAR、PPARα、PPARy),检测细胞中TC和TG含量,油红O染色观察细胞内脂滴分布和半定量分析。⑧采用GEO数据库,分析HBV慢性感染人群肝组织中PTGS2、MLKL与DNM1L基因表达水平和相关性:进一步在Drp1干预模型中,采用DNM1L小干扰RNA(siDNM1L)处理HepG2-Tet-ON-HBx细胞,WB检测坏死性凋亡和线粒体动力相关蛋白表达水平,免疫荧光(IF)观察线粒体形态和检测p-Drp1Ser616蛋白胞内分布;检测细胞中TC和TG含量,油红O染色观察细胞内脂滴分布和半定量分析。⑨COX-2干预模型采用PTGS2小干扰RNA(siPTGS2)处理HepG2-Tet-ON-HBx细胞,WB检测坏死性凋亡和线粒体动力相关蛋白表达水平,IF检测COX-2与线粒体外膜标志蛋白(TOM20)共定位分布;邻位连接实验(PLA)检测COX-2与RIP3的空间邻近;免疫共沉淀(Co-IP)检测COX-2与RIP3的相互作用;检测细胞中TC和TG含量,油红O染色观察细胞内脂滴分布和半定量分析。⑩利用CRISPR/Cas9 技术构建 HepG2-Cas9-PTGS2 及对照细胞 HepG2-Cas9-NC;采用pcDNA3.1-HBx 质粒转染 12 h,给予 AFB1(1μmol/L)处理 48 h 或 72 h 作为 HBx+AFB1暴露组;pcDNA3.1质粒转染和给予等体积DMSO处理作为对照组;进行坏死性凋亡和线粒体动力相关蛋白检测、提取线粒体组分检测RIP3和COX-2蛋白线粒体转位;检测细胞中TC与TG含量,油红O染色观察细胞内脂滴分布和半定量分析。(2)人原代肝细胞的离体试验:采用人肝嵌合(HLC)小鼠,通过注射含有HBV病毒颗粒的HepaAD38细胞(四环素诱导)上清液,构建HBV感染(含HBx表达)模型;以注射不含HBV病毒颗粒的HepaAD38细胞(未加四环素诱导)上清液的HLC小鼠作为对照。进一步采用ALB或HNF4α标记、通过流式分选出再生增殖的人原代肝细胞(PHHs),给予AFB1(0.5 μmol/L)处理48 h或72 h,以等体积DMSO作为溶剂对照,分为对照组(Ctrl)、AFB1暴露组、HBV感染(HBx表达)组、和HBV感染联合AFB1暴露组(HBV+AFB1)。进行细胞形态学观察和如下检测:①qRT-PCR检测肝功能相关基因(HNF4A、ALB)、代谢相关基因(CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4)等mRNA 水平。②WB检测坏死性凋亡相关蛋白(RIP1、RIP3、p-MLKL)、线粒体动态相关蛋白(Drp1、p-Drp1Ser616、Mfn2)、线粒体β氧化相关蛋白CPT1A、以及COX-2表达水平。③TC酶法检测细胞中TC含量,油红O染色观察细胞内脂滴分布并进行半定量分析。(3)体内试验:首先,采用12月龄HBx转基因(HBx-Tg)小鼠和野生型(WT)C57BL/6J小鼠,①采用qRT-PCR检测FABP1、PPARA、PPARG、CPT1A、PTGS2、ACTB等mRNA水平。②WB检测小鼠肝组织中HBx、COX-2、线粒体动态和脂质合成代谢相关蛋白。③检测肝脏组织中TC和TG含量;肝组织冰冻切片后,油红O染色观察肝组织内脂滴分布和半定量分析。④HE染色观察肝脏组织病理改变。其次,进一步采用6月龄HBV转基因(HBV-Tg)小鼠和野生型(WT)小鼠,分别腹腔注射AFB1(5 mg/kg·bw)作为HBV(含HBx表达)+AFB1组和AFB1暴露组、以及等体积溶剂(花生油)作为HBV蛋白(含HBx)表达组和对照组(Ctrl),每两天注射一次,连续注射三次,构建体内染毒模型。最后一次暴露24 h,眼球取血后颈椎脱臼处死,取全血与肝脏组织进行实验。⑤全血室温静置1h后离心,取上层血清检测谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)水平。⑥WB检测小鼠肝组织中HBx表达,以及COX-2、坏死性凋亡、线粒体动态和CPT1A等相关蛋白含量。⑦HE染色观察肝脏组织病理改变。⑧免疫组化(IHC)实验检测肝组织中RIP3、COX-2、p-Drp1 Ser616、HBx等蛋白分布与表达。⑨检测肝组织中TC与TG含量;肝组织冰冻切片后,油红O染色观察细胞内脂滴分布。结果:(1)体外试验:首先,在HepG2.2.15细胞与HepG2细胞、HepG2-Tet-ON-HBx细胞、HepaRG细胞中,与对照组相比:①三种不同层面的肝细胞处理48 h,在HepG2.2.15细胞与HepG2细胞中,AFB1暴露组HepG2细胞中促进脂质合成的PPARG mRNA水平轻微上升,促进脂质代谢的PPARA mRNA水平轻微上升(P>0.05);HBV蛋白表达组细胞中PPARG、PPARA mRNA 水平均不改变(P>0.05);HBV+AFB1 组PPARG mRNA水平显著升高1-2倍(P<0.05),PPARA mRNA水平轻微升高(P>0.05)。上述结果在AFB1和HBx处理的HepG2-Tet-ON-HBx细胞中得到类似验证。在AFB1和HBx处理的HepaRG细胞中,肝功能相关基因(HNF4A、ALB)、代谢相关基因(NR1I2、RXR、CYP1A2、CYP3A4、GSTM1)等mRNA水平显著上升(P<0.05),提示与HepaRG细胞诱导外源物代谢酶活化有关。AFB1暴露组或HBx表达组HepaRG细胞中PPARG mRNA水平显著升高达 5 倍(P<0.05),PPARA mRNA 水平降低到 50%(P<0.05);HBx+AFB1 组HepaRG细胞中PPARG mRNA水平显著升高达16倍(P<0.05),PPARA mRNA水平降低到50%(P<0.05)、CPT1A mRNA水平增高5倍(P<0.05)。②三种不同层面的肝细胞处理48 h,在HepG2.2.15细胞与HepG2细胞中,AFB1暴露组HepG2细胞中坏死性凋亡和线粒体动态相关蛋白、及COX-2表达水平改变;HBV蛋白表达组HepG2.2.15细胞中RIP1、RIP3和p-MLKL蛋白、Drpl和p-Drp1Ser616、以及COX-2蛋白水平增高,Mfn2表达水平降低;HBV+AFB1组HepG2.2.15细胞中坏死性凋亡相关蛋白、线粒体动态相关蛋白、COX-2表达水平与单独处理组相比显著增多,Mfn2表达水平显著下降;上述结果在HepG2-Tet-ON-HBx细胞和HepaRG细胞中同样得到验证。③三种不同层面的肝细胞处理72 h,HepG2.2.15细胞与HepG2细胞中,AFB1暴露组和HBV蛋白表达组中TC与TG水平均不变,HBV+AFB1组TC水平显著上升(P<0.05);除HepaRG细胞瞬时转染pcDNA3.1-HBx质粒引起TG水平显著上升,上述结果在HepG2-Tet-ON-HBx细胞和HepaRG细胞中同样得到验证。HepG2.2.15细胞和HepG2细胞中,油红O染色发现AFB1暴露组和HBV蛋白表达组中平均单个细胞中脂滴轻微增多(P>0.05),HBV+AFB1组细胞中脂滴分布增加、平均单个细胞中脂滴显著增多(P<0.05);上述结果在HepG2-Tet-ON-HBx细胞与HepaRG细胞中同样得到验证。④三种不同层面的肝细胞,MTT结果显示在HepG2.2.15细胞与HepG2细胞中,AFB1暴露组和HBV蛋白表达组细胞活力降低,且HBV+AFB1组细胞存活率显著降低(P<0.05);Nec-1干预处理可使HBV+AFB1组细胞的存活率增高(P<0.05);上述结果在HepG2-Tet-ON-HBx细胞和HepaRG细胞中同样得到验证。其次,⑤与对照组(Ctrl)相比,pHBx+AFB1组HepaRG细胞中线粒体分裂相关蛋白表达上升、融合相关蛋白和CPT1A、StAR表达降低;NSA预处理,可使pHBx+AFB1组HepaRG细胞中线粒体分裂相关蛋白表达降低至对照组水平、融合相关蛋白和CPT1A表达上升至对照组水平;⑥与对照组(Ctrl)相比,pHBx+AFB1 HepaRG细胞中TC含量显著增高(P<0.05),细胞中油红O染色脂滴分布增多;Nec-1或NSA干预处理组HepaRG细胞中TC含量和细胞中油红O染色脂滴分布低于pHBx+AFB1组(P<0.05)、而与对照组未见显著性差异(P>0.05)。第三,⑦利用筛选获得的GSE83148数据,GEO分析发现HBV慢性感染者(n=122)中DNM1L、PTGS2、MLKL mRNA水平显著高于正常人群(n=6),且PTGS2与DNM1L(r=0.5116,P<0.05)和MLKL(r=0.5816,P<0.05)都呈显著正相关。在HBx+AFB1暴露组HepG2-Tet-ON-HBx 细胞中,siDNM1L处理使细胞中 Drp1、p-MLKL、RIP3 降低,线粒体形态部分恢复正常,p-Drp1SCr616蛋白胞内分布减少,p-Drp1Ser616表达降低、Mfn2表达上升,TC含量降低,细胞内油红O染色脂滴含量减少。第四,⑧siPTGS2处理的HBx+AFB1暴露组HepG2-Tet-ON-HBx细胞中,诱导的COX-2、坏死性凋亡相关蛋白、线粒体分裂相关蛋白p-Drp1Ser616表达降低,Mfn2表达部分挽救回升,COX-2与TOM20共定位减少,COX-2与RIP3邻近的PLA荧光数量减少,COX-2与RIP3的Co-IP条带水平降低,TC含量降低,细胞内油红O染色的脂滴含量减少。第五,⑨通过重组质粒测序、转染细胞的qRT和WB鉴定,结果证明HepG2-Cas9-PTGS2细胞构建成功,细胞中COX-2蛋白表达水平敲低至50.95%±1.82%;HepG2-Cas9-NC中,与对照组细胞相比,HBx+AFB1联合暴露组坏死性凋亡相关蛋白(RIP1、RIP3、p-MLKL)、线粒体动力相关蛋白(Drp1、p-Drp1Ser616)表达降低,Mfn2和CPT1A表达增高,RIP3与COX-2在线粒体组分中的分布降低;细胞TC水平降低(P<0.05),单位面积内油红O染色的脂滴分布减少(P<0.05)。HepG2-Cas9-PTGS2细胞中上述现象均无显著差异。(2)人原代肝细胞的离体试验:①PHHs灌流后培养,细胞形态呈圆形、椭圆形或多边形,似薄荷包蛋样,双核与多核细胞占比较多。②与小鼠肝细胞相比,PHHs中HNF4A、ALB mRNA呈高表达水平,IHC染色同样发现HLC小鼠肝脏中部分细胞HNF4α和Alb表达,提示为人原代肝细胞;与永生化HepG2细胞相比,PHHs中CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4等mRNA水平显著升高(P<0.05),提示PHHs具有良好的潜在代谢活性。③灌流的HBV感染HLC小鼠的PHHs与未感染的HLC小鼠PHHs相比,HBx蛋白和mRNA水平均显著升高,证明HBV感染PHHs中有HBx表达。④同时,与对照组相比,HBV感染(HBx表达)组和AFB1暴露组CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4mRNA表达水平显著增高(P<0.05);与HBV感染组和AFB1暴露组相比,HBV+AFB1暴露组CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4 mRNA表达水平进一步增高(P<0.05);各组细胞形态均无明显改变。⑤与对照组相比,HBV感染(HBx表达)组和AFB1暴露组细胞中RIP 1、RIP3 和 p-MLKL、Drp1 和 p-DrplSer616、CPT1A、以及 COX-2 表达水平无显著改变;与HBV感染(HBx表达)与AFB1暴露组相比,HBV+AFB1组细胞中RIP1、RIP3和p-MLKL、Drp1和p-Drp1Ser616水平增高,CPT1A水平降低,提示线粒体动态和脂质β氧化的改变。⑥与对照组相比,HBV感染(HBx表达)组和AFB1暴露组细胞中TC和TG含量增高,细胞中油红O染色脂滴分布增多;与HBV感染(HBx表达)组和AFB1暴露组相比,HBV+AFB1组TC和TG水平显著增高、细胞中脂滴分布增多(P<0.05)。结果验证模拟人体内HBV感染(HBx表达)肝细胞联合AFB1暴露可诱导PHHs坏死性凋亡、线粒体动态改变和脂质蓄积的发生。(3)体内试验:首先,与WT小鼠相比,HBx-Tg小鼠肝组织中,①脂质合成相关的FABP1和PPARG基因、及PTGS2 mRNA水平显著上升;肝细胞脂肪酸代谢相关基因PPARA、CPT1A mRNA水平下降。②HBx、COX-2、PPARγ蛋白表达水平增高,PPARα和CPT1A蛋白表达降低。③TC和TG含量升高;肝组织内油红O染色脂滴分布增多(P<0.05)。④HE染色观察到HBx-Tg小鼠肝脏组织中肝细胞出现空泡,提示肝脏可能发生脂质蓄积。其次,与WT小鼠相比,各处理组HBV-Tg小鼠中,⑤与WT对照组相比,HBV蛋白(含HBx)表达组、AFB1暴露组、HBV(含HBx表达)+AFB1组小鼠血清中ALT、AST水平均上升(P<0.05),但HBV(含HBx表达)+AFB1组与单独AFB1暴露或单独HBV(含HBx表达)组相比,无显著差异。⑥HBV-Tg小鼠肝组织中HBx表达,HBV蛋白(含HBx)表达组和AFB1暴露组小鼠肝组织中坏死性凋亡和线粒体动态相关蛋白、以及COX-2蛋白表达轻微增高;HBV(含HBx表达)+AFB1组小鼠肝组织中RIP1、RIP3和p-MLKL、Drp1和p-Drp1Ser616、以及COX-2表达显著增高,CPT1A表达显著降低。⑦肝脏病理检查发现HBV(含HBx表达)+AFB1组小鼠肝组织中肝细胞空泡化、细胞核深染、肝索断裂、出现炎性侵润。⑧HBV蛋白(含HBx)表达组和AFB1暴露组肝组织中RIP3、COX-2、p-Drp1Ser616蛋白在肝细胞内免疫组化(IHC)阳性分布比例和表达水平增高,HBV(含 HBx 表达)+AFB1 组小鼠肝脏中 HBx、RIP3、COX-2、p-Drp1Ser616 蛋白在连续切片的同一肝细胞位置表达水平增高,提示HBV感染(HBx表达)联合AFB1暴露的肝组织(肝细胞)中COX-2表达、线粒体动态和坏死性凋亡之间的关联性和潜在调控作用。⑨HBV蛋白(含HBx)表达组和AFB1暴露组小鼠肝脏中TC与TG水平略上升、肝细胞中油红O染色脂滴分布略增加;HBV(含HBx表达)+AFB1组小鼠肝脏中TC与TG水平显著增高,且肝细胞中油红O染色脂滴分布显著增加(P<0.05)。提示HBV感染(HBx表达)联合AFB1暴露介导的肝组织中细胞内脂质蓄积。结论:建立HBx表达肝细胞和HBV感染肝组织(肝细胞)联合AFB1暴露的体内外试验模型,可诱导肝细胞发生坏死性凋亡和介导肝细胞内脂质蓄积,与诱导肝细胞COX-2表达和线粒体转位与RIP3交互作用介导线粒体动态调节和脂质代谢紊乱有关,靶向干预COX-2表达可调控HBx表达和AFB1共同暴露诱导的肝细胞坏死性凋亡和脂质蓄积。结果为进一步探明HBx与AFB1联合暴露诱导肝细胞毒性的调控机制、探讨预防和控制肝损伤及相关疾病的潜在靶点提供依据。