实时荧光PCR技术具有高灵敏度、高特异性、无需PCR反应后处理步骤等优点,近年来被广泛应用于分子生物学研究领域,尤其在临床检验方面,该技术提供了有力的支持。针对日益完善的实时荧光PCR技术和种类越来越多的荧光探针技术,本研究设计了一种新型的荧光探针——等长双链荧光探针,又称Y型荧光探针,并围绕该关键技术展开了研究。研究工作主要包括Y型荧光探针的设计组合,应用Y型荧光探针对常见的病原微生物进行实时定量的检测。文章分为两部分。在第一部分,首先,我们对不同组合的Y型荧光探针进行了筛选、优化,找到最佳的检测探针组成。然后,我们以肠出血性大肠杆菌O157为检测目标,以该细菌的rbfE基因为检测靶序列,从探针的熔解曲线、检测的特异性和灵敏度等几个方面系统的考察了新型Y型荧光探针检测细菌DNA的效果。通过实验,我们可以特异地从肠出血性大肠杆菌O157 ,伤寒沙门氏菌,福氏志贺菌,肠侵袭性大肠杆菌O4,弗劳地氏枸橼酸杆菌,产毒素大肠杆菌等16株常见菌中检测出肠出血性大肠杆菌O157。另外,以肠出血性大肠杆菌O157阳性标准株10倍的梯度稀释液作为检测灵敏度的模板,结果可以在1.49×103 CFU/mL浓度下特异地检测出目的菌。第二部分,应用新型Y型荧光探针对禽流感H5亚型病毒进行了检测实验。我们选择保守的HA基因作为靶序列,系统优化了检测RNA病毒的Y型荧光探针反应体系和反应条件。结果表明,由Y型荧光探针建立的检测体系可以在1.5 h左右特异地检测出高致病力的禽流感H5亚型。通过对病毒标准株RNA的梯度稀释,