目的:目前,缺血性脑病的发病率在全球不断上升,形势也日益严峻。多年来,许多研究人员致力于研究脑缺血耐受机体的内源性保护机制,以期提高神经细胞对缺血性损害的抵抗力,使其在遭受较严重的缺血打击后仍保持存活,并在恢复供血后仍具有正常的生理功能。　　 我室既往研究证实,反复3次股动脉夹闭和再灌的肢体缺血预处理(limb ischemic preconditioning,LIP)可减轻随后即刻发生的脑缺血再灌注引起的大鼠海马CA1区锥体神经元延迟性死亡和凋亡、诱导脑缺血耐受,证实了远隔器官缺血预处理对脑的保护作用。虽然脑缺血的发生无法预测,但是在心肺分流术等一些发生脑缺血危险几率较高的手术中,全脑缺血性损伤是可以预知的。如果能在损伤发生之前就施予干预措施,无疑具有重要的现实意义。因此,探讨LIP脑保护作用的机制可为开发神经保护药物或方法提供新的思路。　　 MAPK是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在哺乳类细胞目前已发现存在着下述三条并行的MAPKs信号通路:ERK、JNK和p38MAPK通路。我室既往采用免疫组织化学、硫堇染色以及Westernblot等方法研究证实,p38MAPK参与了LIP诱导的大鼠脑缺血耐受,并且在这一过程中上调了HSP70的表达、抑制了凋亡通路、改变了超氧化物歧化酶的活性。但是,p38MAPK的神经保护机制尚不完全清楚。　　 谷氨酸是中枢神经系统最主要的兴奋性神经递质,但过高浓度的谷氨酸又具有极强的神经毒性。脑缺血时,细胞外液中谷氨酸等兴奋性氨基酸浓度异常升高,通过钙超载、干扰能量代谢等导致细胞损伤。细胞外谷氨酸清除的主要途径是兴奋性氨基酸转运体(excitatory amino transporters,EAATs)摄取谷氨酸。目前已发现五种高亲和力谷氨酸转运体:GLAST(EAAT1)、GLT-1(EAAT2)、EAAC1(EAAT3)、EAAT4和EAAT5。研究证实,GLT-1在防止其兴奋性毒性作用方面发挥着更为重要的作用。因此,对GLT-1进行调制,增强其对细胞外液中谷氨酸的摄取以及防止其出现逆向转运,是防止脑缺血时细胞外液中谷氨酸浓度异常升高及其神经毒性作用的有效方法。我室研究发现,脑缺血预处理可抑制全脑缺血打击引起的海马CA1区锥体神经元的延迟性死亡,同时可上调海马CA1区GLT-1的表达,抑制脑缺血引起的细胞外液中谷氨酸浓度的升高;而应用GLT-1特异性抑制剂DHK或GLT-1反义寡聚脱氧核苷酸后,均能剂量依赖性的阻断脑缺血预处理对全脑缺血大鼠的神经保护作用,提示GLT-1参与了脑缺血预处理诱导的脑缺血耐受。　　 那么,LIP诱导的脑缺血耐受是否有GLT-1的参与呢？如果有,GLT-1与我们先前研究的p38MAPK之间是否有级联关系？实际上,既往文献中有关p38MAPK对GLT-1调制作用的研究已有报道。2009年,Tsai等在百日咳毒素致热痛觉过敏大鼠模型中发现,p38MAPK特异性抑制剂SB203580能减轻此种痛敏反应、增加脑脊液中兴奋性氨基酸、下调谷氨酸转运体的表达。此外,Matos等在阿耳茨海默氏病的研究中证实,SB203580能够下调星形胶质细胞中GLT-1的表达。我室在近期的工作中,也证实了p38MAPK通过调制GLT-1在脑缺血预处理诱导的脑缺血耐受中发挥了重要作用。　　 因此,本研究的目的在于:①观察LIP不同时间窗对脑缺血再灌注损伤的影响,并应用GLT-1特异性抑制剂DHK,观察抑制GLT-1表达对LIP诱导的脑缺血耐受的影响;②观察并比较LIP后大鼠海马CA1区p38MAPK和GLT-1表达的时间过程;③应用p38MAPK抑制剂SB203580,观察抑制p38MAPK后,大鼠海马CA1区GLT-1表达的变化。通过上述研究,探讨p38MAPK是否通过调制GLT-1参与肢体缺血预处理诱导的脑缺血耐受,为脑缺血性疾病的防治提供新的思路。　　 1、LIP减轻大鼠全脑缺血再灌注引起的海马CA1区迟发性神经元死亡及GLT-1在此过程中的作用　　 1.1、观察LIP不同时间窗对脑缺血再灌注损伤的影响　　 50只Wistar大鼠永久凝闭双侧椎动脉恢复两天后,随机分为四组:①全脑缺血的sham组(n=5):暴露双侧颈总动脉8min,但不阻断血流;②全脑缺血组(n=5):夹闭双侧颈总动脉8min后恢复再灌注;③LIP+全脑缺血组(n=35):夹闭双侧股动脉10min、再灌流10min,反复3次,之后行8min全脑缺血,根据LIP与全脑缺血间隔时间不同分为LIP0h、LIP1h、LIP3h、LIP6h、LIP12h、LIP1d和LIP2d组;④LIP的sham+全脑缺血组(n=5):根据③中结果选择脑保护效果最好的时间点,即暴露双侧股动脉后即刻(LIP0h组)行8min全脑缺血。以上各组大鼠在sham手术或末次缺血再灌后7d断头取脑,冠状切片后分别进行硫堇染色和HE染色。低倍镜下观察硫堇染色的海马组织形态,参照Kitagawa(1990)和Kato(1991)分级方法,对海马CA1区确定组织学分级(histologicalgrade,HG),标准如下:0级:无神经元死亡;Ⅰ:散在神经元死亡;Ⅱ级:成片神经元死亡;Ⅲ级:几乎全部神经元死亡。高倍镜计数双侧海马CA1区每1mm区段内细胞膜完整、胞核饱满、核仁清晰的锥体细胞数目,每张切片双侧海马各计数3个区段,取平均数作为神经元密度(neuronal density,ND)。HE染色观察胶质细胞的变化。　　 硫堇染色结果显示,全脑缺血的sham组大鼠海马CA1区锥体细胞排列整齐、致密,为2～3层,无细胞缺失,细胞形态完整、边界清晰,胞核饱满、核仁深染、清晰,无明显的延迟性神经元死亡(delayed neuronal death,DND),HG为0级,ND值为167±5.21(cells/mm,下同)。全脑缺血组与LIP的sham+全脑缺血组大鼠海马CA1区有明显的组织学损伤,出现严重的DND,锥体细胞形态改变明显,几乎全部神经元死亡或缺失,HG均为Ⅲ级,ND值分别为36±9.28、35±5.93,与全脑缺血的sham组相比,HG明显升高(P＜0.01),ND值明显降低(P＜0.01)。然而,LIP+全脑缺血组大鼠在0h,1h,3h,6h各时间点海马CA1区锥体神经元均未见明显损伤,尤其是LIP0h组锥体细胞排列整齐,仅个别锥体细胞胞核固缩,无明显细胞缺失,与LIP的sham组相比,HG(0～Ⅰ)明显降低、ND值(154±5.93)明显升高(P＜0.05)。然而在LIP12h、LIP1d和LIP2d组,锥体神经元细胞缺失较多,发生严重的DND,与LIP的sham组比较,HG(Ⅱ～Ⅲ)及ND值(分别为46±7.66、40±7.69和42±10.80)均无显著性差别。这些结果表明,LIP对即刻(0h)、1h、3h和6h后发生的脑缺血再灌注损伤有明显的对抗作用,且以LIP后即刻最为明显,从而减轻了大鼠全脑缺血再灌注引起的海马CA1区迟发性神经元死亡。　　 HE染色结果显示,全脑缺血的sham组大鼠海马CA1区锥体细胞排列整齐、致密,为2～3层,细胞形态正常,核仁清晰,胞核圆而大,染色浅呈蓝色,胞浆呈淡红色。绝大多数小胶质细胞处于未激活状态,细胞呈长形,细胞核为三角形。全脑缺血组与LIP的sham组大鼠海马CA1区神经元发生变性、坏死,细胞固缩、核膜消失,细胞核碎裂、溶解,染色较深。小胶质细胞增生,细胞从长形变成圆形,胞浆变丰富。大量凋亡细胞的核染色质致密深染。LIP+全脑缺血组大鼠在0h、1h、3h和6h各时间点海马CA1区锥体神经元均未见明显损伤,细胞大小形态正常,染色较均匀。小胶质细胞未激活,核膜清晰、染色较浅。然而,在LIP12h、LIP1d和LIP2d组锥体神经元细胞损伤明显,细胞核有不同程度的碎裂、溶解,随着时间延长损伤加重,染色加深。上述结果表明,大鼠在脑缺血过程中产生了炎症反应,而LIP即刻(0h)、LIP1h、LIP3h和LIP6h组对之后发生的脑缺血引起的炎症反应有明显的减缓作用,并且以LIP即刻组最为明显。　　 1.2、应用GLT-1抑制剂DHK抑制GLT-1的功能,观察对LIP脑保护作用的影响　　 50只Wistar大鼠永久凝闭双侧椎动脉恢复两天后,随机分为7组:①全脑缺血的sham组(n=5):暴露双侧颈总动脉8min,但不阻断血流;②全脑缺血组(n=5):夹闭双侧颈总动脉8min后恢复再灌注;③LIP的sham组+全脑缺血(n=5):暴露双侧股动脉50min后,夹闭双侧颈总动脉8min后恢复再灌注;④LIP+全脑缺血组(n=5):夹闭双侧股动脉10min、再灌流10min,反复3次,即刻夹闭双侧颈总动脉8min后恢复再灌注;⑤人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid,ACSF)组(n=5):右侧脑室注射ACSF20μl;⑥DHK+LIP+全脑缺血组(n=20):右侧脑室注射DHK溶液20μl,30min后夹闭双侧股动脉10min、再灌流10min,反复3次,即刻夹闭双侧颈总动脉8min后恢复再灌注,根据DHK的剂量进一步分为10nmol、100nmol、200nmol和400nmol亚组;⑦DHK组(n=5):右侧脑室注射DHK溶液20μl,30min后夹闭双侧股动脉10min、再灌流10min,反复3次,DHK的剂量根据⑥中结果选取抑制效果最佳的一组。以上各组大鼠均于末次操作后7d后断头取脑,切片行硫堇染色,在光学显微镜下观察海马CA1区的迟发性神经元死亡情况,确定病理学分级,并计数神经元密度(标准同上)。观察GLT-1的特异性抑制剂DHK对LIP诱导脑缺血耐受的影响。　　 硫堇染色结果显示,全脑缺血的sham组大鼠海马CA1区无明显的DND,HG为0级,ND值为181±8.29。全脑缺血组大鼠海马CA1区出现明显的DND,与全脑缺血的sham组相比,HG(Ⅲ级)明显升高(P＜0.01),ND值(27±8.64)显著降低(P＜0.01)。LIP+全脑缺血组海马CA1区锥体神经元无明显损伤,与全脑缺血组相比,HG(0～Ⅰ级)明显降低(P＜0.01),ND值(174±12.77)显著升高(P＜0.01),表明LIP可以诱导大鼠海马CA1区神经元产生缺血性耐受。右侧脑室注射ACSF后,大鼠海马CA1区组织形态与LIP+全脑缺血组基本一致,无统计学差异。在DHK+LIP+全脑缺血组,大鼠海马CA1区出现显著的DND,并且随着DHK剂量的增加,其HG逐渐升高,10nmol组和100nmol组为Ⅰ～Ⅱ级,200nmol组为Ⅱ～Ⅲ级,400nmol组为Ⅲ级;ND逐渐下降,分别为121±10.91、82±10.35、16±5.71和8±6.04。然而,单纯右侧脑室给予DHK200nmol对海马CA1区HG(0～Ⅰ级)和ND值(158±11.31)均无明显影响,提示DHK无明显的神经元毒性作用。以上结果表明,GLT-1特异性抑制剂DHK可剂量依赖性地阻断LIP的神经保护作用。　　 2、P38MAPK是否通过调制GLT-1参与LIP诱导的脑缺血耐受　　 2.1、LIP对大鼠海马CA1区p-p38MAPK和GLT-1表达的影响　　 110只Wistar大鼠除Control组外其余大鼠均永久凝闭双侧椎动脉后恢复两天:①Control组(n=10):不做任何处理;②LIP+全脑缺血组(n=100):夹闭双侧股动脉10min、再灌注10min、反复3次,即刻夹闭双侧颈总动脉8min,然后恢复再灌注。以上各组大鼠均于末次操作后0h、30min、1h、3h、6h、12h、1d、3d、5d、7d断头取脑,各组各时间点分别取5只用于免疫组织化学、其余5只用于Western blotting检测大鼠海马CA1区p-p38MAPK和GLT-1的表达,并比较其时间关系。　　 GLT-1的免疫组化结果显示,control组海马CA1区未见明显的GLT-1表达,染色较浅,平均光密度和阳性细胞总面积分别为2.66±0.71和5035.02±1087(μm2,下同)。LIP+全脑缺血后各时间点海马CAI区GLT-1的表达均有不同程度的上调,在锥体细胞周围形成一定的“网格”状。在LIP+全脑缺血后即刻(0h)、30min、1h、3h和6h时间点平均光密度和总面积均有所增加,着色逐渐加深,但与control组相比无统计学差异(P＞0.05)。而LIP+全脑缺血后12h、1d、3d时间点海马CAI区GLT-1的表达明显增多,以1d时间点最为明显,染色比较深,星型细胞及其突起出现强的点状、条状阳性标记,其平均光密度和阳性细胞总面积分别10.81±0.93和21351.19±2025,与control组相比有统计学差异(P＜0.01)。LIP+全脑缺血5d、7d时间点海马CA1区GLT-1的表达逐渐减少,染色逐渐变浅,与control组相比无统计学差异(P＞0.05)。P-p38MAPK的免疫组化结果显示,control组海马CA1区中未见明显的p-p38MAPK阳性表达,染色较浅,平均光密度和阳性细胞总面积分别为1.65±0.28和5486.19±3596(μm2,下同)。LIP+全脑脑缺血后各时间点海马CA(Ⅰ)区神经元中p-p38MAPK的表达均有不同程度的上调,即刻时间点阳性细胞表达量较少,胞核着色浅。在LIP+全脑缺血30min、1h、3h时间点,阳性细胞平均光密度和总面积均有所增加,但与control组相比无统计学差异(P＞0.05)。然而,LIP+全脑缺血6h、12h和1d时间点海马CA(Ⅰ)区p-p38MAPK的表达明显增多,以12h最为明显,胞核着色明显加深,呈深棕黄色,其平均光密度和阳性细胞总面积分别9.22±0.87和49762.16±7799,与control组相比有统计学差异(P＜0.01)。LIP+全脑缺血3d时间点p-p38MAPK的表达开始减低,LIP+全脑缺血5d、7d时胞核着色明显变浅,与control组相比无统计学差异(P＞0.05)。　　 Western blot结果显示,control组海马CA1区GLT-1的表达量极低。LIP+全脑缺血后各时间点中GLT-1的表达均有不同程度上调。其中LIP+全脑缺血后即刻(0h)、30min、1h、3h和6h时间点与control组相比无统计学差异(P＞0.05)。从LIP+全脑缺血12h开始,GLT-1的表达明显增多,1d达到高峰,持续到3d,与control组相比有统计学差异(P＜0.01)。LIP+全脑缺血5d后GLT-1的表达开始降低,7d时基本降到即刻水平。control组海马CA1区p-p38MAPK的表达量很少。LIP+全脑缺血后各时间点中p-p38MAPK的表达有不同程度增多,但是即刻(0h)、30min、1h、3h时间点与control组相比无统计学差异(P＞0.05)。从6h开始p-p38MAPK的表达明显增多,12h达到高峰,并持续到1d左右,与control组相比有统计学差异(P＜0.01)。LIP+全脑缺血3d后p-p38MAPK的表达开始下降,持续到7d时降至起始水平。　　 以上结果表明:LIP能够上调脑缺血大鼠海马CA1区p-p38MAPK和GLT-1的表达,且p-p38MAPK表达上调开始时间和表达高峰时间均早于GLT-1。　　 2.2、应用p38MAPK抑制剂抑制p38MAPK后,观察大鼠海马CA1区GLT-1表达的变化　　 40只Wistar大鼠永久凝闭双侧椎动脉恢复两天后,随机分为五组:①LIP+全脑缺血组(n=5):夹闭双侧股动脉10min、再灌注10min、反复3次,即刻夹闭双侧颈总动脉8min,然后恢复再灌注。②DMSO+LIP+全脑缺血组(n=5):右侧脑室注射DMSO溶液25μl,30min后夹闭双侧股动脉10min、再灌流10min,反复3次,即刻夹闭双侧颈总动脉8min后恢复再灌注;③SB203580+LIP+全脑缺血组(n=20):右侧脑室注射SB203580溶液25μl,30min后夹闭双侧股动脉10min、再灌流10min,反复3次,即刻夹闭双侧颈总动脉8min后恢复再灌注,根据SB203580的剂量进一步分为50μmol、100μmol、200μmol和400μmol四个亚组;④SB203580的sham组(n=5):右侧脑室注射SB203580溶液25μl(400μmol)。⑤全脑缺血的sham组(n=5):暴露双侧颈总动脉8min,但不阻断血流。以上各组大鼠均于末次操作后1d(根据2.1中结果,选取GLT-1的表达高峰时间点)断头取脑,免疫组织化学检测海马CA1区GLT-1的表达。　　 免疫组化结果显示,全脑缺血的sham组海马CA1区神经元内有少量GLT-1的表达,染色浅,弥散性分布,平均光密度和阳性细胞总面积分别为6.17±0.6和11394.17±1225(μm2,下同)。SB203580的sham组海马CA1区神经元内GLT-1的表达也较少,与全脑缺血的sham组相比无显著差异(P＞0.05),平均光密度和阳性细胞总面积分别为5.85±0.9和10984.5±1185。提示抑制剂SB203580无明显的神经元毒性作用。LIP+全脑缺血组海马CA1区神经元GLT-1的表达明显上调,染色较深,为深棕黄色,星型胶质细胞及其突起出现强的点状、条状阳性标记,其平均光密度和阳性细胞总面积分别为10.74±0.85、19951.19±1508。SB203580+LIP+全脑缺血组海马CA1区神经元中GLT-1的表达明显降低,随着剂量的加大降低更加明显。与LIP+全脑缺血组相比,平均光密度显著降低(P＜0.01),分别为4.03±0.55、2.84±0.54、2.46±0.5、2.38±0.31。阳性细胞总面积也明显降低(P＜0.01),分别为9645.17±1140、8032.16±1197、6844.36±929、5780.43±939。DMSO+LIP+全脑缺血组GLT-1阳性细胞表达比较多,与LIP+全脑缺血组相比,平均光密度和阳性细胞总面积均无显著差异(P＞0.05),分别为9.04±0.96、18339.8±1103。以上结果表明,p38MAPK的特异性抑制剂SB203580能剂量依赖性的阻断LIP诱导的脑缺血耐受过程中GLT-1表达的上调。　　 结论:　　 1、LIP不同时间窗可减轻随后发生的脑缺血再灌注引起的海马CA1区锥体神经元的延迟性死亡,其中以LIP后即刻(0h)作用最为显著。　　 GLT-1特异性抑制剂DHK可剂量依赖性地阻断LIP抗脑缺血打击的作用,表明GLT-1促进了LIP诱导的大鼠脑缺血耐受。　　 2、LIP能够上调大鼠海马CA1区p-p38MAPK和GLT-1的不同步表达,p-p38MAPK的表达上调开始时间和表达高峰时间均早于GLT-1。　　 SB203580通过抑制p-p38MAPK的功能,剂量依赖性地阻断了LIP诱导的GLT-1的表达上调,从而影响LIP诱导的脑缺血耐受过程。提示,p38MAPK通过调制GLT-1参与了LIP诱导的脑缺血耐受。