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1.斜带石斑鱼肝细胞分离及原代培养方法的建立通过不同的分离方法和培养条件探索斜带石斑鱼肝细胞的原代培养,以建立稳定可靠的斜带石斑鱼肝细胞原代培养模型,同时观察长期培养过程中肝细胞的形态变化。采用组织块分离法和胰蛋白酶(含EDTA)消化法分离肝细胞,并通过密度梯度离心法分离纯化肝细胞,细胞悬液于DMEM/F-12、M199和L-15培养液中培养;细胞活力及数量采用血球计数板计数,并通过MTT法测定细胞增殖率;同时,测定不同时间培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活性、白蛋白(ALB)和尿素氮(BUN)水平,分析原代培养肝细胞生长状态。结果表明,斜带石斑鱼肝细胞原代培养不适合采用组织块方法,而胰蛋白酶消化法则获得良好稳定的培养效果,细胞产量达到1.6×108 cells/g肝重,活细胞数达到95%;L-15培养基细胞生长明显优于DMEM/F-12和M199两种培养基;启动原代培养的48-72 h阶段肝细胞生长代谢旺盛,培养上清中LDH活性显著降低(P<0.05),ALB和BUN含量显著升高(P<0.05)。结果显示,0.25%的胰蛋白酶常温消化法适合斜带石斑鱼肝细胞的分离,斜带石斑鱼肝细胞原代培养的最适培养基为L-15培养基,肝细胞在启动原代培养的48-72h生长代谢旺盛。2.皮质醇对斜带石斑鱼原代培养肝细胞活性及功能的影响本研究利用肝细胞体外培养模型,旨在探讨皮质醇对斜带石斑鱼原代培养肝细胞活性及功能的影响。选取5个皮质醇浓度(0、1、10、100、1000 nmol/L)孵育斜带石斑鱼原代肝细胞24 h,采用MTT法检测肝细胞活性,并测定肝细胞培养上清液中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和乳酸脱氢酶(LDH)活性以及尿素氮(BUN)和白蛋白(ALB)水平的变化,分析细胞生长代谢状态。结果显示,高浓度皮质醇(100、1000 nmol/L)组作用24 h即可导致肝细胞ALT、AST、LDH释放量显著增加(P<0.05),BUN分泌量也显著升高(P<0.05);当皮质醇浓度为1000 nmol/L时,显著降低了肝细胞的活性(P<0.05)。结果表明:高浓度的皮质醇对体外培养肝细胞的功能及活性产生不利影响。3.皮质醇对原代培养肝细胞糖和脂肪代谢的影响以斜带石斑鱼原代培养肝细胞为模型,选取3个皮质醇浓度(0、100 nmol/L和1000nmol/L)和2个孵育时间(24 h和36 h),通过测定培养上清液中葡萄糖含量,肝细胞糖原、丙酮酸和甘油三酯含量,肝细胞糖和脂肪代谢关键酶的活性和基因表达量,以及脂肪代谢相关的转录因子基因表达,探讨离体条件下皮质醇对斜带石斑鱼肝细胞糖和脂肪代谢的影响。研究结果表明,在孵育24 h和36 h时,皮质醇显著提高肝细胞葡萄糖的释放量,而显著降低肝细胞丙酮酸和甘油三酯含量(P<0.05);皮质醇作用时间对肝细胞葡萄糖释放量、肝细胞丙酮酸和甘油三酯含量均无显著性影响(P>0.05)。在肝细胞孵育24 h时,皮质醇对肝细胞糖原含量无显著影响(P>0.05),而孵育36 h时,肝细胞糖原含量则随着皮质醇水平的升高而显著降低(P<0.05)。随着皮质醇作用时间的延长,肝细胞糖原含量显著下降(P<0.05)。在孵育24 h和36 h时,皮质醇显著提高了磷酸烯醇式丙酮酸激酶(PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)的活性,显著降低了苹果酸脱氢酶(MDH)和异柠檬酸脱氢酶(ICD)的活性(P<0.05),但对糖原合成酶(GSase)活性则无显著影响(P>0.05);在孵育24 h时,皮质醇对丙酮酸激酶(PK)活性无显著影响(P>0.05),但在孵育36 h时,皮质醇则显著提高丙酮酸激酶(PK)活性(P>0.05)。随着孵育时间的延长,葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)活性显著下降,丙酮酸激酶(PK)活性显著升高(P<0.05),而苹果酸脱氢酶(MDH)和异柠檬酸脱氢酶(ICD)活性均无显著影响(P>0.05)。在孵育24 h和36 h时,皮质醇显著上调了PEPCK和G6Pase基因表达量(P<0.05);孵育24 h时,皮质醇显著上调PK基因表达量(P<0.05),但孵育36 h时则对PK基因表达量无显著影响(P>0.05)。随着皮质醇孵育时间的延长,G6Pase和PK基因表达量显著升高(P<0.05)。皮质醇对MDH基因表达量无显著影响(P>0.05)。皮质醇显著下调了脂肪酸合成酶(FAS)和过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARα)基因表达量(P<0.05),孵育时间对FAS和PPARα基因表达量无显著影响(P>0.05)。皮质醇显著上调了脂蛋白脂肪酶(LPL)和激素敏感脂肪酶(HSL)基因表达量(P<0.05),然而孵育时间对HSL基因表达无显著影响(P>0.05),但LPL基因表达则随着孵育时间的延长而显著增加(P<0.05)。结果显示:皮质醇提高原代培养肝细胞的糖异生能力,抑制脂肪合成,促进脂肪分解。