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目的：
短肽CTTHWGFTLC(CTT)是近年利用噬菌体展示技术筛选出来的可特异性抑制基质金属蛋白酶2、9(matrix metalloproteinase,MMP-2、MMP-9)的环状十肽。体内外实验证明CTT能有效抑制肿瘤细胞的侵袭和转移,并具有良好的肿瘤靶向性,在抗肿瘤方面有应用的前景。但短肽CTT主要由疏水氨基酸构成,水溶性差,而且CTT作为小分子肽存在稳定性差、体内容易降解的缺点,在药物开发和应用方面作用有限。
本研究拟从改善水溶性、增加稳定性和增强其抗肿瘤效能出发,对短肽CTT的分子结构进行改造,在CTT的氨基端引入RGD功能肽序列,设计合成CTT的衍生肽RGDSY-CTTHWGFTLC(RGDSY-CTT),并比较观察RGDSY-CTT与CTT在水溶性、活性和抗肿瘤能力方面的差异,为开发更高效的肽类抗肿瘤药物奠定实验理论基础。
方法：
1.设计并合成短肽RGDSY-CTT,同时合成环肽CTT和线性肽STTHWGFTLS(STT)作为阳性和阴性对照。
2.将终浓度为80μg/ml的Ⅳ型胶原酶(成分为:MMP-2、MMP-9)、1.25mg/ml的酶底物酪蛋白分别与终浓度为250、500μg/ml的RGDSY-CTT、CTT、STT混合,37℃孵育1h,通过酪蛋白水解抑制实验检测RGDSY-CTT、CTT、STT抑制Ⅳ型胶原酶水解底物的活性,重复3次。
3.取RGDSY-CTT、CTT各0.25、0.5、1.0、2.0 mg分别溶于0.5 ml蒸馏水,充分溶解后离心取上清,以蛋白定量BCA法对比观察RGDSY-CTT与CTT的溶解度,每组测3次。
4.免疫组化法检测48例人类乳腺癌组织及10例正常人类乳腺组织MMP-2、MMP-9的表达。
5.明胶酶谱法检测乳腺癌MCF-7细胞MMP-2、9的表达。
6.MCF-7细胞接种于预涂布纤连蛋白(Fn,10μg/ml)50μl/孔的96孔板,分别加入终浓度为50、100、200μg/ml的RGDSY-CTT、CTT、STT,并以相应浓度的DMSO作为空白对照孵育2h,每组重复6孔,PBS洗3次洗去未粘附细胞,四甲基偶氮唑盐微量酶反应(MTT)法比较RGDSY-CTT与CTT对MCF-7细胞粘附能力的影响。
7.MCF-7细胞接种于Transwell小室的上室,分别加入终浓度为100、200μg/ml的RGDSY-CTT、CTT、STT,并以相应浓度的DMSO(RGDSY-CTT、CTT、STT是以DMSO助溶)作为空白对照孵育12h,每组重复5孔,比较RGDSY-CTT与CTT对MCF-7细胞运动能力的影响。
8.在Transwell小室聚碳酸酯膜的上室面预铺基质胶(BME,2mg/ml)50μl,接种MCF-7细胞于上室,分别加入终浓度为100、200μg/ml的RGDSY-CTT、CTT、STT,并以相应浓度的DMSO作为空白对照孵育16h,每组重复5孔,比较RGDSY-CTT与CTT对MCF-7细胞侵袭能力的影响。
9.MCF-7细胞接种于96孔板,分别加入终浓度为50、100、200μg/ml的RGDSY-CTT、CTT、STT,并以相应浓度的DMSO作为空白对照孵育24h,每组重复6孔,MTT法比较RGDSY-CTT与CTT对MCF-7细胞增殖能力的影响。
10.MCF-7细胞接种于六孔板,分别加入终浓度为200μg/ml的RGDSY-CTT、CTT、STT,并以相应浓度的DMSO作为空白对照孵育24h,每组重复3孔,PI染色流式细胞仪比较RGDSY-CTT与CTT对MCF-7凋亡和细胞周期的影响。
结果：
1.短肽的合成：化学合成RGDSY-CTT、CTT、STT三个肽,经HPLC检测纯度均大于95％,质谱分析结果与目标肽分子量相符。
2.短肽的活性：在浓度为250μg/ml时RGDSY-CTT对IV型胶原酶水解酪蛋白的抑制率为53.6％,CTT的抑制率为77.7％；而在高浓度500μg/ml时,两者抑制率分别为94.6％和96.9％。提示RGDSY-CTT随着浓度增加抑制率有上升趋势,但在浓度低于500μg/ml时其抑制活性低于CTT。
3.短肽的溶解度：经蛋白定量BCA法检测得:CTT的溶解度约为745.0μg/ml,而RGDSY-CTT在四个浓度检测组均完全溶解,最高检测浓度为4030.0μg/ml,提示RGDSY-CTT溶解度大于4030.0μg/ml,水溶性较CTT明显增强。
4.乳腺癌组织MMP-2、MMP-9的表达：48例乳腺癌组织有MMP-2蛋白表达者45例(93.75％),MMP-9蛋白表达者38例(79.17％),而在10例正常乳腺组织中未检测到MMP-2和MMP9蛋白的表达。MMP-2和MMP-9在发生淋巴结转移组比未转移组明显高表达,差异有统计学意义(P<0.05)。
5.明胶酶谱法检测MCF-7细胞MMP-2、9的表达：在MCF-7培养上清中检测到MMP-2、9的表达,以MMP-2更为显著。
6.短肽对MCF-7细胞粘附能力的影响:RGDSY-CTT在终浓度为50、100、200μg/ml时,MCF-7细胞的粘附率依次降低为：85.1％、74.1％、63.8％,粘附率显著低于CTT处理组(P<0.01=。CTT与STT在浓度为50、100、200μg/ml时对MCF-7细胞粘附能力的影响与空白对照相比均无显著差异(P>0.05)。提示RGDSY-CTT在浓度为50、100、200μg/ml时对MCF-7细胞的粘附能力有明显抑制,浓度越高,抑制作用越强,而CTT在相同浓度与空白对照组相比对MCF-7细胞的粘附能力无显著影响(P>0.05)。
7.短肽对MCF-7细胞运动能力的影响：在浓度为100μg/ml时RGDSY-CTT与CTT对MCF-7细胞的运动抑制率分别为42.9％和39.2％,在浓度为200μg/ml时抑制率分别上升为60.8％和57.0％：两个浓度RGDSY-CTT的抑制作用均比CTT强(P<0.05=;线性肽STT与空白对照组比对MCF-7细胞的运动能力无明显抑制作用(P>0.05)。提示RGDSY-CTT与CTT对MCF-7细胞的运动能力均有明显的抑制作用,而RGDSY-CTT抑制能力比CTT更强。
8.短肽对MCF-7细胞侵袭能力的影响：在浓度为100μg/ml时RGDSY-CTT与CTT对MCF-7细胞的侵袭抑制率分别为41.8％和39.5％,在浓度为200μg/ml时抑制率分别上升为63.9％和61.9％；两个浓度RGDSY-CTT与CTT的抑制作用无明显组间差别(P>0.05);线性肽STT与空白对照组比对MCF-7细胞的侵袭能力无明显抑制作用(P>0.05)。提示RGDSY-CTT与CTT对MCF-7细胞的侵袭能力有明显抑制作用,两组间抑制作用无明显差异(P>0.05)。
9.短肽对MCF-7细胞增殖的影响:RGDSY-CTT在浓度为50、100、200μg/ml时MCF-7细胞的增殖率依次降低为：98.8％、82.4％、63.0％,增殖率显著低于CTT处理组(P<0.01=。CTT与STT在浓度为50、100、200μg/ml时对MCF-7细胞的增殖能力与空白对照组相比均无显著差异(P>0.05)。提示RGDSY-CTT在浓度为100、200μg/ml时对MCF-7细胞的增殖能力有明显抑制,浓度越高,抑制作用越强,而CTT在相同浓度与空白对照组相比对MCF-7细胞的增殖能力无显著影响(P>0.05)。
10.短肽对MCF-7细胞凋亡和细胞周期的影响:RGDSY-CTT处理组MCF-7细胞经流式细胞仪检测到凋亡峰,细胞周期阻滞发生在G0/G1期,占76.7％,显著高于CTT组(P<0.01=;CTT、STT、空白对照组均未见凋亡峰,G0/G1期细胞比例分别为55.1％、53.6％和54.3％,CTT、STT组与空白对照组比G0/G1期细胞比例无明显差别(P>0.05)。提示RGDSY-CTT可诱导细胞凋亡和引起细胞阻滞,而CTT无此功能。
结论：
1.新合成短肽RGDSY-CTT的水溶性较CTT明显改善。
2.RGDSY-CTT具有比CTT更强的运动抑制能力和相近的侵袭抑制能力,并获得了抑制肿瘤细胞粘附、增殖和诱导肿瘤细胞凋亡的能力。