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非酒精性脂肪性肝(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指除外酒精和其他明确损肝因素所致的,以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变为主要特征的临床病理综合征。肥胖与NAFLD存在大量的流行病学关联,有高达50%的肥胖儿童和青少年出现NAFLD,且起病隐匿。因此,积极探讨儿童期NAFLD发生的病理生理机制,实现成年期疾病在儿童的早期防治,已成为全球健康领域亟待解决的问题。1998年,Lucas将早期营养状况对成年疾病的代谢程序化作用定义为“营养程序化(Nutritional programming)”,即在发育关键或敏感时期的营养状况将对机体或各器官功能产生长期以至终身的影响。生命早期营养环境与成年期肥胖和NAFLD的发生密切相关。肝脏是机体进行脂代谢的主要场所,当脂肪酸流入(摄入、合成)超过流出(氧化、输出)时,过多的甘油三酯(triglyceride,TG)即在肝脏沉积,导致NAFLD发生,这些过程与脂代谢酶和核受体密切相关,并受到膳食的影响。早期过度营养可持续上调肝脏的脂合成酶表达水平,增加成年期NAFLD发生的风险,但早期营养如何介导肝脏脂合成代谢程序化改变的机制并不明确,且缺乏预防和治疗NAFLD的确切靶标。脂肪组织是全身最大的内分泌器官,通过脂源性细胞因子、酶、转录因子等,与肝脏、脑、胰腺等对话(Cross Talk),参与肥胖所致代谢性疾病的病理进程。神经调节蛋白4(neuregulin4,Nrg4)是众多脂源性细胞因子之一,属神经调节蛋白家族(NRGs)。研究发现脂肪组织来源的Nrg4是连接肥胖和脂肪肝的重要内分泌因子,能有效控制肝脏脂合成的源头,减少饮食诱导的NAFLD发生。Nrg4在棕色脂肪组织(Brown Adipose Tissue,BAT)中表达丰富,皮下脂肪组织(subcutaneous adipose tissue,SAT)次之,内脏 WAT(visceral adipose tissue,VAT)最少,这与脂肪组织棕色化能力一致。而寒冷、药物、营养素等则可通过不同途径诱导WAT棕色化改变,上调产热相关基因如Ucpl、PGC1α表达,增加产热消耗能量。提示通过诱导WAT的棕色样变,有可能增加Nrg4表达,降低肥胖导致的肝脏脂代谢紊乱。ω3 长链多不饱和脂肪酸(ω3-polyunsaturated fatty acid,ω3-PUFA)作为过氧化物酶增殖体激活受体 γ(Peroxisomen proliferator-activated receptor γ,PPARγ)的天然配体,是脂肪细胞分化转录调节的关键分子,影响脂肪细胞的分化进程及最终分化方向。研究指出,ω3-PUFA膳食干预后,大鼠可恢复正常的产热代谢,减少脂肪组织积聚。因此,在不断探索Nrg4在脂肪细胞中的调控通路的同时,从营养干预的角度,挖掘参与前脂肪细胞向棕色脂肪细胞分化调控的新成员、新机制,有助于开启Nrg4调控干预NAFLD的新领域。因此,我们假设:1)早期过度营养可降低产热,抑制脂肪组织Nrg4表达,增加高脂诱导的NAFLD的发生;ω3-PUFA膳食干预能诱导脂肪组织棕色样变,增加机体产热,提高Nrg4表达,降低NAFLD的发生风险;2)ω3-PUFA(EPA)对脂肪细胞Nrg4表达的调控存在时间和剂量差异;3)ω3-PUFA(EPA)通过PPARγ途径调节白色脂肪细胞的棕色样变,促进Nrg4的表达和分泌;4)外源性的Nrg4抑制脂肪肝细胞中脂合成酶表达,减少脂质合成。为验证这些假设,我们开展了系列研究,现汇报如下:第一部分早期营养模式对脂肪组织Nrg4表达的影响及其与NAFLD的关系目的观察早期喂养模式对大鼠脂肪组织中Nrg4表达、肝脏脂代谢的影响及其与NAFLD的关系。方法1.建立哺乳期过度喂养动物模型,即SD大鼠生后3天,雄性仔鼠随机分为哺乳期正常喂养组(Normal Litters,NL,每只母鼠哺育10只仔鼠)和哺乳期过度营养组(Small Litters,SL,每只母鼠哺育3只仔鼠)。断乳后,NL组大鼠分别予正常膳食(NL)和高脂饮食(NL-HF),SL组大鼠分别予正常膳食(SL)、高脂膳食(SL-HF)和ω3-PUFA膳食(SL-FO),并喂养至13周。2.定期监测大鼠体重、摄食量、体温。并于3周、13周时观察大鼠糖脂代谢、肝脏和脂肪组织重量及形态变化。13周时进行肝脏B超检查,并采用动物代谢笼系统分析大鼠O2消耗量、CO2产出量和产热量。3.采用实时荧光定量PCR检测脂肪组织中Nrg4、Ucp1、PPARγ、PGC1α和PRDM16以及肝脏中脂代谢相关基因的mRNA表达水平,TG检测试剂盒测定肝脏内TG含量。结果1.干预终期,SL组大鼠体重、肝脏重量高于NL组(P<0.05);NL-HF组和SL-HF组大鼠体重、肝脏重量高于对照组,且SL-HF组更为明显(P<0.05);而SL-FO组大鼠体重、肝脏重量低于SL组(P<0.05)。2.SL组大鼠体温、O2消耗、CO2生成和产热量明显低于NL组(P<0.05),NL-HF组和SL-HF组大鼠体温、O2消耗、CO2生成和产热量明显低于对照组(P<0.05),而SL-FO组大鼠体温、O2消耗、CO2生成和产热量较SL组明显增加(P<0.05)。3.SL组大鼠肝脏TG含量高于NL组(P<0.05),且B超呈现轻度脂肪肝改变;NL-HF组和SL-HF组大鼠肝脏TG水平较对照组明显升高(P<0.05),并呈现脂肪肝,且SL-HF组更为明显,已有中度脂肪肝;SL-FO组大鼠肝脏TG含量与NL组相比无明显差异(P>0.05),且两组大鼠B超均无异常改变。4.断乳后SL组大鼠肝脏脂合成基因ACC、SCD1、FASN及其核转录因子SREBP-1cmRNA表达水平即高于NL组(P<0.05),并持续至13周;高脂饮食进一步增加SL组大鼠脂合成相关基因表达(P<0.05);SL-FO组大鼠上述肝脏脂合成相关基因表达明显降低(P<0.05);成年期NL组和SL组大鼠肝脏脂肪酸摄入、氧化和输出相关基因mRNA表达水平无显著差异(P>0.05)。5.全身多种组织中均可表达Nrg4,其表达丰度为BAT>SAT>VAT>肺、心脏、肝脏等其他外周器官组织。SL组大鼠BAT、SAT和VAT中Nrg4表达水平较NL组明显降低(P<0.05);高脂饮食可降低SAT和VAT中Nrg4表达水平(P<0.05),但不影响BAT中Nrg4表达水平(P>0.05);SL-FO组大鼠BAT、SAT和VAT中Nrg4表达水平显著增加(P<0.05)。6.SL 组、NL-HF 组和 SL-HF 组大鼠 BAT 和 VAT 中 Ucp1、BAT、SAT 和VAT中PGC1α mRNA表达水平较NL组明显降低(P<0.05);SL-FO组大鼠BAT 和 VAT 中 Ucp1、BAT、SAT 和 VAT 中 PGC1α mRNA 表达水平与 SL 组相比显著增加(P<0.05)。结论脂肪组织中Nrg4表达水平存在明显的部位差异,哺乳期和断乳后是脂肪组织Nrg4表达调控的关键期,早期过度营养可抑制BAT和WAT中Nrg4表达并持续至成年,断乳后ω3-PUFA膳食干预可诱导WAT棕色样变,恢复BAT和WAT中Nrg4表达水平,抑制肝脏脂合成酶表达,降低成年期NAFLD的发生风险。第二部分二十碳五烯酸对不同来源脂肪细胞Nrg4表达的调控作用和分子机制目的探讨二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic Acid,EPA)对不同分化阶段和不同来源脂肪细胞Nrg4表达的调控及其分子机制。方法1.培养并诱导人内脏前体脂肪细胞HPA分化为成熟脂肪细胞,在诱导分化的不同阶段分别给予不同浓度EPA干预,确定EPA上调Nrg4表达和分泌的最佳干预时间和干预剂量。2.从3-4周C57BL/6小鼠的BAT和SAT提取原代前体脂肪细胞,并诱导分化为成熟棕色脂肪细胞(brown adipocyte,BAC)和白色脂肪细胞(white adipocyte,WAC),在诱导分化的不同阶段分别给予不同浓度EPA干预,确定EPA上调Nrg4表达的最佳干预时间和干预剂量。3.观察PPARy激动剂(罗格列酮,Rosiglitazone,Rosi)和拮抗剂(GW9662)作用对HPA脂肪细胞Nrg4表达和分泌的影响。4.采用油红O染色技术观察脂肪细胞脂质堆积变化,实时荧光定量PCR检测不同脂肪细胞中Nrg4、Ucp1、PPARγ、PGC1α和PRDM16mRNA表达水平,并采用ELISA检测HPA脂肪细胞培养上清中Nrg4蛋白含量。结果1.油红O染色显示,随着HPA、BAC和WAC分化成熟,细胞中脂滴均逐渐增多,Nrg4mRNA表达水平明显上调,并在HPA分化第12天、BAC和WAC分化第8天达到高峰。2.EPA上调脂肪细胞Nrg4表达存在明显的时间和剂量效应。晚期干预虽可增加Nrg4表达,但所需EPA浓度(BAC、WAC、HPA细胞分别20、50、200μM)明显高于分化全程需要的EPA浓度(10、50、10μM)。3.Rosi作用HPA脂肪细胞分化晚期或全程,可显著增加Nrg4 mRNA表达水平及培养上清中Nrg4含量(P<0.05),而GW9662抑制EPA对HPA脂肪细胞中Nrg4 mRNA表达水平及培养上清中Nrg4含量的上调作用(P<0.05)。4.EPA或Rosi干预均可显著减少脂肪细胞中的脂质积聚,上调Ucp1和PGC1α mRNA表达水平(P<0.05),而GW9662则可抑制EPA对脂肪细胞Ucp1和PGC1αmRNA表达水平的上调作用(P<0.05)。结论Nrg4的表达水平随着脂肪细胞的分化成熟逐渐增多。EPA能够上调HPA细胞、BAC和WAC中Nrg4的表达水平,并呈现明显的时间和剂量效应,生理剂量EPA的长期暴露,更有利于诱导脂肪细胞棕色样改变并上调Nrg4表达水平。激活或抑制PPARγ,均可显著影响脂肪细胞Nrg4表达和分泌水平,提示PPARγ是EPA调控脂肪细胞棕色样变、促进Nrg4表达和分泌的重要途径。第三部分Nrg4对肝细胞脂合成代谢的保护作用目的探讨Nrg4对肝细胞脂代谢相关基因表达的调控作用。方法构建ErbB4过表达腺病毒,使ErbB4在HepG2细胞中过表达,用油酸钠(sodiumoleate,OA)诱导HepG2细胞建立脂肪肝细胞模型,并应用重组Nrg4蛋白(10-200ng/ml)作用于脂肪变的HepG2细胞48h,观察Nrg4干预对HepG2细胞内脂质积聚、TG含量以及脂代谢相关基因表达的影响。采用实时荧光定量PCR检测HepG2细胞中脂代谢相关基因mRNA表达水平,油红O染色技术观察肝细胞脂质堆积变化,TG检测试剂盒测定肝细胞内TG含量。结果1.OA诱导ErbB4过表达的HepG2细胞,细胞内脂滴增多、TG含量较对照组明显增加(P<0.05),最终建立脂肪肝细胞模型。2.OA诱导后,HepG2细胞内脂合成相关基因(ACC、SCD1、FASN)及其核转录因子(SREBP-1c)mRNA表达水平较对照组明显增加(P<0.05),脂质输入相关基因(LPL、L-FABP)、输出相关基因(MTP)、氧化相关基因(CPT1)及其核转录因子(PPARα)mRNA表达水平较对照组明显降低(P<0.05)。3.Nrg4(≥100ng/ml)作用过表达ErbB4受体的HepG2细胞48h,可显著降低细胞内脂质积聚、TG含量(P<0.05),抑制OA诱导引起的脂合成相关基因mRNA表达水平上调(P<0.05),但对输入、输出、氧化相关基因及其核转录因子mRNA表达水平无显著影响(P>0.05)。结论Nrg4通过ErbB4途径抑制OA诱导的脂合成基因ACC、SCD1、FASN及其核转录因子SREBP-1c mRNA表达上调,减少细胞中的脂质积聚。