登革病毒(Dengue virus,DENV)是登革热、登革出血热和登革休克综合征的病原体,有四种血清型(DENV1-4),其中DENV-2毒力最强。近年来DENV感染呈扩大蔓延之势,发病率不断升高,DENV感染已经成为热带、亚热带地区严重的社会公共卫生问题之一。DENV在分类上属于黄病毒科的黄病毒属,是单股正链RNA病毒。关于它的复制机理,尤其是RNA复制的分子机制尚不清楚。最近一些研究显示,除了病毒蛋白外,宿主蛋白在病毒翻译和复制调控中起着重要作用。迄今为止,仅有少数参与DENV复制周期的宿主蛋白被鉴定出来,其中RNA结合蛋白(RBP)在病毒RNA代谢、修饰以及终止翻译和启始RNA合成中起到重要作用。DENV基因组非编码区5’UTR和3’UTR是宿主RBPs的主要结合区域,在病毒的复制和翻译中起着重要调控作用。本研究以DENV-2为研究对象,利用RNA亲和捕捉法联合质谱技术分别对细胞外和细胞内组装的DENV-2 5’-3’UTR-蛋白复合体进行分离鉴定,并进一步对其中的部分候选蛋白在DENV-2基因组复制过程中的作用进行了研究,为进一步理解DENV-2基因组复制机制提供了有益的理论基础和实验依据。同时,本研究还建立了一步法分离细胞内RNA-蛋白复合物的技术对于分离和阐明宿主RBP在单股正链RNA病毒中的调控作用提供了重要的技术平台。【主要实验方法和研究结果】1.分离与鉴定DENV-2 RNA 5’-3’UTR结合的宿主蛋白首先将DENV-2 5’UTR和3’UTR c DNA克隆到p CI-neo载体中构建p CI-5’-3’UTR质粒;单酶切后以含有T7启动子的5’-3’UTR为底物体外转录生成5’-3’UTR RNA;然后将带生物素标记的寡核苷酸直接添加到5’-3’UTR RNA的3’末端,生成5’-3’UTR-bio RNA;5’-3’UTR-bio RNA与胞浆蛋白孵育后,通过链亲和素偶联的磁珠直接分离胞浆中与5’-3’UTR-bio RNA结合的宿主蛋白。与单独磁珠组相比,5’-3’UTR-bio RNA组的SDS-PAGE结果显示共有9个特异的差异条带;对9个胶条进行质谱鉴定,结果显示共有78个潜在的与5’-3’UTR RNA结合的宿主蛋白;选择PB小体组分LSm1蛋白和DEx D/H蛋白家族成员DDX21,进一步分析了它们在DENV-2复制过程中的作用。为了探究LSm1蛋白在DENV-2复制过程中的作用机制,首先通过RT-q PCR实验检测了DENV-2感染细胞不同时间点LSm1 m RNA水平,结果显示:随着病毒感染时间延长,DENV-2 RNA和LSm1 m RNA的水平均逐渐升高。随后将针对LSm1靶基因的si RNA转染到Hep G2细胞中,使细胞中LSm1低表达,观察对DENV-2 RNA复制的影响,RT-q PCR实验结果显示:LSm1低表达的细胞中DENV-2 RNA水平降低。收获DENV-2感染低表达LSm1细胞的培养上清,通过流式细胞仪测定培养上清中子代DENV-2感染细胞的比例,以此明确细胞中低表达LSm1蛋白对子代DENV-2产出的影响,结果显示:低表达LSm1蛋白的细胞中子代DENV-2颗粒产生减少。为了分析研究DENV-2 RNA与LSm1的相互作用,利用激光共聚焦显微镜观察了LSm1蛋白在DENV-2感染细胞中的分布,结果显示:LSm1蛋白与ds RNA在胞浆中的核周围存在共定位。RNA免疫沉淀试验(RIP)的结果进一步表明LSm1蛋白直接与DENV-2 RNA的3’UTR结合。以上结果提示,在DENV-2感染的细胞中,LSm1蛋白表达升高,并且被募集到DENV-2复制的场所,与病毒3’UTR RNA结合,从而增强DENV-2的RNA复制。为了研究DDX21蛋白在DENV-2复制中的作用机制,首先通过Western blotting检测了DENV感染细胞不同时间点DDX21的蛋白表达水平,结果表明:DDX21蛋白水平在病毒感染后12 h和24 h显著下降,在感染后36 h恢复并高于正常水平。然后观察DDX21蛋白在DENV-2感染前后的细胞内分布情况,分别收获DENV感染和未感染细胞细胞核和细胞质蛋白,Western blotting检测DDX21的蛋白水平,结果显示:DENV-2感染的细胞中,细胞核中的DDX21蛋白水平显著下降,而细胞质中的DDX21蛋白水平略微上升,但无统计学意义。同时用激光共聚焦显微镜检测DDX21蛋白在DENV-2感染和未感染细胞中的分布,结果显示:在DENV-2感染的细胞中,DDX21在细胞核中的染色强度减弱,而DDX21在细胞质中的染色并没有显著变化。随后我们分别在细胞低表达和过表达DDX21,然后感染DENV-2并通过RT-q PCR检测DENV-2 RNA复制的水平,结果显示:DDX21低表达的细胞中DENV-2RNA表达增高,而其在DDX21过表达的细胞中明显降低。为了明确DDX21蛋白在抑制DENV-2复制过程中的机制,我们又通过双荧光素酶活性实验检测了DENV-2感染细胞中IFN-β和IFN报告基因的活性,结果显示:过表达DDX21蛋白的细胞受到DENV-2感染后,IFN-β和干扰素激活反应元件(ISRE)的反应水平显著升高。为了进一步探索DENV-2如何拮抗DDX21的抑制功能,我们将DDX21与DENV-2丝氨酸蛋白酶复合体NS2b/3的真核表达载体共转染细胞后,Western blotting检测DDX21蛋白水平,结果显示:转染DENV-2 NS2b/3的细胞中DDX21的水平明显降低。随后在培养液中加入蛋白酶抑制MG132后,Western blotting检测结果显示,与NS2b/3共转染的细胞中DDX21水平无明显变化。以上研究结果提示,在DENV-2感染的细胞中,定位于细胞核的DDX21蛋白被募集到细胞质中,参与激活IFN等固有免疫应答,从而抑制病毒复制;随后DENV-2 RNA翻译产生的丝氨酸蛋白酶复合物NS2b/3将细胞质中的DDX21降解,从而拮抗了DDX21的抗病毒作用。RIP的实验结果表明DDX21蛋白在上述过程中与DENV-2 RNA的3’UTR有相互作用。2.分离细胞内组装的DENV-2 5’-3’UTR-RBP复合物方法的建立鉴于体外合成RNA组装的RNP可能与细胞内自然状态下形成的不同,为了克服体外分离RBP方法存在的局限,本研究探索建立了分离细胞内组装DENV-25’-3’UTR RNA与宿主蛋白复合物的新方法。首先我们将DENV-2 5’-3’UTR c DNA和生物素样S1序列克隆到RNA转录载体p HH21中,构建p HH21-5’-3’U-S1质粒。然后将上述质粒转染细胞后,在细胞内转录生成5’-3’UTR-S1 RNA,与宿主蛋白结合细胞内组装RNA-RBP复合物。细胞经365 nm UV交联后,通过链亲和素包被的磁珠RNA亲和捕捉法分离细胞内组装的5’-3’UTR-S1-RBP复合物。SDS-PAGE的结果显示有3个特异胶条,质谱分析共有32个可能与5’-3’UTR结合的宿主蛋白。为进一步分析IGF2BP m RNA小体的组分RPS8蛋白在DENV-2复制中的作用,我们首先利用RT-q PCR法检测了DENV-2感染过表达RPS8的细胞中DENV-2 RNA表达水平,结果显示:RPS8过表达的细胞中,DENV-2 RNA水平明显升高。同时收获了DENV-2感染过表达RPS8蛋白的细胞培养上清,培养上清倍比稀释后感染BHK-21细胞后染色,空斑形成实验结果显示:DENV-2感染过表达PRS8的细胞上清中产出更多子代病毒。然后利用RIP实验检测了DENV-2 RNA与RPS8的结合情况,结果显示:RPS8抗体的RIP产物中可以扩增5’UTR和3’UTR。同时,激光共聚焦显微镜的观察结果表明RPS8与ds RNA在胞浆中存在共定位。上述实验结果表明,RPS8与DENV-2 RNA的5’UTR和3’UTR均有结合,它可能作为病毒复制复合物的一部分促进DENV-2在细胞内的复制。【结论】本研究建立的两种RNA亲和捕捉方法均能成功筛选到与DENV-2 5’-3’UTR相互作用的宿主蛋白。我们发现LSm1和RPS8等宿主蛋白均可促进DENV-2复制,LSm1通过3’UTR与DENV-2 RNA结合,RPS8蛋白与DENV-2 RNA 5’UTR和3’UTR均有相互作用。DDX21在感染早期抑制DENV-2的复制,而它可被DENV NS2B/3蛋白酶复合体降解从而有利于病毒的复制。本研究为进一步理解DENV-2基因组复制机制提供了有益的理论基础和实验依据。同时,建立的一步法分离细胞内RNA-蛋白复合物的技术对于分离在单股正链RNA病毒中起到调控作用的宿主RBP提供了新方法。