在真核细胞中，染色质是由DNA，组蛋白，非组蛋白以及少量的RNA组成的。染色质的基本单位是核小体。核小体是由146 bp的左手超螺旋DNA缠绕着组蛋白八聚体组成的。组蛋白八聚体是由进化上比较保守的核心组蛋白H2A，H2B，H3， H4各两个单体构成。连接组蛋白则可以将DNA锁定在核小体上。在不同生物中，连接组蛋白在进化上不保守，在维持基因组的稳定性，特定基因的转录调控，染色质重塑，以及DNA损伤修复等方面发挥着重要的作用。　　嗜热四膜虫（Tetrahymean thermophila）具有传统纤毛虫特异的大核和小核的细胞双核体系。大核和小核中具有结构不同的组蛋白H1。小核特异组蛋白MLH1（micronuclear linker histone）在生长期表达量低，而在有性生殖时期表达水平显著提高，然而其具体的生物学功能并不清楚。本研究对Mlh1在四膜虫中的功能进行了系统分析研究，获得主要结果如下：　　1. MLH1基因的生物信息学分析 MLH1（TTHERM_00471820）在四膜虫大核基因组中无内含子序列，开放阅读框1902 bp，编码633个氨基酸。含有21.5％的赖氨酸和23.1%的丝氨酸。序列中含有一个较为保守的HMG-box结构域（93-158aa），该结构域属于 II/III类的 HMG-box超家族。与四膜虫高迁移率族蛋白 HmgB3（TTHERM_00155590）的HMG-box有35%的一致性。MLH1在营养生长期和饥饿前期有较低的表达，饥饿后期几乎不表达，而在有性生殖时期表达水平显著提高，有性生殖时期6h达到最高。　　2. Mlh1在不同发育阶段的定位 Mlh1在生长发育的不同时期会水解成不同的片段α，β，γ，δ。分别构建了含HA-tag和Flag-tag的pXS75-MLH1、pXS75-MLH1-α、pXS75-MLH1-β、pXS75-MLH1-γ、 pXS75-MLH1-δ载体，转化嗜热四膜虫细胞中，利用巴龙霉素抗性筛选出突变株。免疫荧光定位分析表明，在营养生长期 HA-Mlh1定位在小核上，而HA-α，HA-β，HA-γ，HA-δ定位在胞质中，表明全长Mlh1对于小核连接组蛋白的入核是必须的。营养生长期HA-Mlh1定位在小核上，而Mlh1-Flag没有定位在小核上，表明全长 Mlh1入核后很快发生了水解。在有性生殖早期， HA-Mlh1定位在小核上，且定位信号不断扩大，定位模式类似于纺锤体结构。在Crescent时期，HA-Mlh1可以与α-tubulin共定位于小核上。在小核完成第二次减数分裂后，HA-Mlh1定位信号消失。结果表明，Mlh1参与减数分裂小核的拉伸。　　3. MLH1的过表达导致四膜虫异常的有性生殖0.15μg/ml的Cd2+诱导生长期突变株2 h，通过DAPI染细胞核DNA，显微镜下进行突变株有性生殖时期核发育观察，发现突变株在有性生殖期间出现无规则的小核和松散的染色质，突变株不能完成有性生殖。核发育概率统计显示，MLH1的过表达抑制了合子核的形成和发育，减数分裂后形成的配子大部分凋亡，少部分能发育到anlagen时期，之后配对细胞分开。　　4. MLH1的敲除影响四膜虫的有性生殖构建敲除载体pBsr-MLH1后，基因枪转化入四膜虫细胞内，通过杀稻温菌素梯度浓度筛选得到稳定突变株ΔMLH1。缺对PCR检测结果表明突变株存在小核染色体的丢失。核发育概率统计和γ-H2A.X定位信号结果显示，突变株在第二次减数分裂后，选择核不能完成DNA断裂修复，之后配子凋亡。结果暗示，MLH1的缺失会影响选择核的DNA断裂修复，进而影响合子核的发育及后期的有性生殖进程。Mlh1可能和DNA损伤修复相关。　　5. MLH1和HMGB3可能存在功能上的补偿通过四膜虫功能基因组数据库分析，发现MLH1和高迁移率蛋白HMGB3有着相似的表达图谱。此外，Mlh1和HmgB3有着相似的一级氨基酸序列结构特性。RT-qPCR分析，发现在ΔMLH1细胞中，HMGB3的表达水平较野生型细胞有了明显的提高；在ΔHMGB3细胞中，MLH1的表达量也较野生型细胞有了明显的提升。 MLH1和HMGB3的双敲除突变株对MMS较为敏感，且有性生殖缺陷比 MLH1的单敲除细胞株表型严重。以上结果表明 MLH1和HMGB3可能存在功能上的补偿作用。　　本研究首次对MLH1在四膜虫有性生殖时期的定位和功能进行了系统分析；有性生殖早期，HA-Mlh1定位在小核上，且定位信号不断扩大，定位模式类似于纺锤体结构。在Crescent时期，HA-Mlh1可以与α-tubulin共定位于小核上。MLH1的过表达不仅抑制了合子核的形成和发育，还形成了无规则的小核以及松散的染色质。MLH1的敲除会影响选择核的DNA断裂修复，进而影响合子核的发育及后期的有性生殖进程。此外，组蛋白MLH1和高迁移率蛋白HMGB3可能存在功能冗余性。连接组蛋白Mlh1的正常表达对四膜虫细胞核的稳定性和有性生殖进程是必需的。