【摘 要】
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近几年,位点特异性整合的转基因猪的研究备受研究人员关注,但多基因定点整合的转基因猪却鲜有报道。通过CRISPR/Cas9介导的外源基因敲入已在改善转基因猪的性状方面取得了重大成就,然而,单基因敲入的转基因动物很难同时达到改善两个或多个性状的效果,这对于费时费力的转基因动物制备是极大的浪费。因此,同时插入多个外源基因以改善转基因动物的多种性状是目前亟待解决的问题。本研究通过CRISPR/Cas9介导
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近几年,位点特异性整合的转基因猪的研究备受研究人员关注,但多基因定点整合的转基因猪却鲜有报道。通过CRISPR/Cas9介导的外源基因敲入已在改善转基因猪的性状方面取得了重大成就,然而,单基因敲入的转基因动物很难同时达到改善两个或多个性状的效果,这对于费时费力的转基因动物制备是极大的浪费。因此,同时插入多个外源基因以改善转基因动物的多种性状是目前亟待解决的问题。本研究通过CRISPR/Cas9介导的同源重组技术,在猪基因组Rosa26位点实现了两个外源基因的定点整合和有效表达。外源基因的表达盒分两种:一种选用Fat-1和IGF-1两个已知功能的编码基因作为外源基因,并通过自切割多肽2A和内部核糖体进入位点（IRES）进行调控;第二种选用一个Fat-1编码基因、一个抗猪流行性腹泻病毒的shRNA作为外源基因,且Fat-1由EF1α启动子驱动。利用电转染将2种的打靶载体分别与Cas9/sg RNA载体共转染进胎儿成纤维细胞,经有限稀释法获得了阳性的成纤维细胞克隆,整合效率高达5.2%,并结合SCNT技术制备了2种模式的转基因克隆猪。阳性细胞克隆RT-q PCR结果说明,外源基因整合至猪ROSA26位点,内源性启动子可以驱动外源基因的转录、猪Rosa26位点整合外源性启动子（如EF1α）可以启动外源基因的转录、猪Rosa26位点整合外源性调控元件（如2A?IRES）可以调控外源基因协同表达。气相色谱分析表明,转基因猪中的n-3PUFAs含量显着增加,n-6PUFAs/n-3PUFAs的比例从6.982降至3.122（***P<0.001）。F0代仔猪各组织RT-q PCR和Western-blot结果进一步表明,定点整合在猪Rosa26位点的多个外源基因在个体水平均能正常转录和有效表达。本研究多个基因在同一位点的定点整合转基因动物的制备具有一定的参考意义,同时对加速多个外源基因精准整合,开发具有多个优良经济性状的转基因猪新品种提供了新的技术支撑。
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