环境中存在数以万计的外源化学物,其中部分的化学物被证明为人类致突变物和(或)致癌物。然而大部分的致突变物原型并不具备致突变性,而需要经过体内各种酶的代谢活化后才能展现,这类致突变物又称为间接致突变物。一些间接致突变物导致机体产生突变/畸形的机制己被透彻阐述,但相当一部分的间接致突变物其代谢途径、引起靶器官效应机制等仍存在疑团。多氯联苯(PCBs)是一类环境持久性有机污染物。虽然目前法律已禁止其生产,但在少部分工业中、室内燃烧中依旧能够生成。大量的实验证明,多氯联苯与诸多疾病发生有关,包括影响神经发育、干扰内分泌系统和诱发恶性肿瘤等,其已于2013年被国际癌症研究机构(IARC)列为人类第一类致癌物。目前研究已知PCBs的羟化作用是导致其获得致突变性的重要步骤,而这一步反应依赖于CYPs酶系的作用,但具体由哪个CYPs亚型催化尚不清楚。有研究显示,二恶英类似PCBs (DL-PCBs)能够通过芳烃受体(AHR)的持续激活高效诱导CYP1家族蛋白表达,CYP1A1、1A2等为这类PCBs的潜在代谢酶,但目前还缺乏其介导PCBs遗传毒性的报告。在本课题组前期研究中发现人CYP2E1可以活化多个非二恶英类似PCBs (NDL-PCBs)为致突变物。但其他CYPs亚型是否参与PCBs的代谢活化、其活化作用强度,及其与CYPE1相比对PCBs作用有何结构选择性尚不清楚。因此需要一种表达多种CYP亚型的模型来观察。L-02细胞为人正常肝细胞系,已报道它具有人CYP1A1、1A21、1B1、2E1、3A4等CYPs亚型的内源性表达。本研究拟采用既往在重组V79细胞系观察到具有依赖于人CYP2E1的强致突变性的PCBs和L-02细胞进行微核试验,观察选择性CYP2E1抑制剂对PCBs以及依赖于其它CYPs代谢活化的间接致突变物诱发微核效应的影响,以此探索各种CYPs对受试PCBs代谢活化作用的相对强度。同时构建表达人CYP1A1的V79衍生细胞,以它作为与通过AHR途径诱导的CYPs酶系的代表来进一步验证以L-02细胞为模型的发现。苯是经典的间接致突变物,其在人类生活以及工业中广泛存在与应用。早在1982年已由国际癌症研究署(IARC)确定为环境致癌物。以往认为苯在进入人体后,于肝脏中由CYP2E1代谢成苯酚、氢醌,之后这些中间产物经血液进入骨髓由髓过氧化物酶活化为苯醌,引起致突变效应并最终导致白血病的发生。与苯(最简单的芳香族化合物)不同,1-甲基芘是烷基化多环芳烃的典型代表,其通过各种人类活动如吸烟、汽车尾气以及熏制食品产生。尽管通过生化试验以及细菌致突变试验已发现1-甲基芘能由多种CYP酶亚型活化为1-羟甲基芘,再经SULT酶活化为终毒物1-磺基甲基芘,但是这些实验仅通过合成的中间代谢物1-羟甲基芘来观察,尚缺乏哺乳动物细胞相关的毒性研究。本课题组前期研究通过微核试验发现,人CYP2E1具有持续活化苯成为醌类终毒物的能力。同时用微核试验与次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(Hprt)位点致突变试验观察到1-甲基芘经过Ⅰ相和Ⅱ相代谢酶连续活化引起遗传毒性效应。但是它们在细胞毒性方面数据有待完善,本次研究采用MTT或CCK-8试验检测苯及其羟化代谢物、1-甲基芘以及1-羟甲基芘对V79-hCYP2E1-SULT1A1诱导的细胞毒性强度。方法1.采用CCK-8试验分析2,3,3’-三氯联苯(PCB 20)和2,3,4’-三氯联苯(PCB22)对L-02细胞生存/生长的影响,每组设6个重复测试。根据细胞毒性决定微核试验的浓度范围(细胞存活率60%以上),观察L-02细胞暴露于PCB 20与PCB 22后微核细胞发生频率。同时观察CYP2E1选择性抑制剂反式1,2-二氯乙烯(DCE)以及二甲亚砜(DMSO)共培养对微核形成的影响。CYP2E1抑制条件(DMSO 2%o, v:v)下,L-02细胞中其他CYPs亚型(CYP1A1、1B1、1A2以及3A4)的特异性代谢活化能力以苯并(a)芘和黄曲霉毒素B1 (AFB1)诱导微核形成来反映。每个浓度组设计3个重复测试。2.采用编码野生型人CYP1A1基因的真核表达载体转染V79细胞,经抗生素筛选,并通过蛋白免疫印迹与CYP1A1依赖性间接致突变物诱发微核,鉴定所表达的酶蛋白的免疫原性和酶活性,从而构建稳定表达人CYP1A1的重组V79细胞系(V79-hCYP1A1)。在此基础上,采用CCK-8试验和微核试验观察PCB52,74,77及81分别对V79-hCYP2E1与V79-hCYP1A1细胞的细胞毒性和遗传毒作用。细胞暴露于受试化合物12h后继续培养12h,每个浓度组CCK-8试验重复6个测试,微核试验设计3个重复测试。3.采用MTT法或CCK-8法分析苯及其羟化代谢物、1-甲基芘以及1-羟甲基芘对V79-hCYP2E1-hSULTlA1细胞(V79细胞衍生细胞,重组表达人CYP2E1与人SULT1A1)生存/生长的影响。CYP2E1与SULT1A1酶在这些细胞毒效应中的作用(代谢活化或解毒),则依据其特异抑制剂1-氨基苯并三唑与五氯苯酚共培养对细胞存活/生长的影响来判断。每组设置6个重复测试。4.统计学分析MTT、CCK-8与微核试验结果以均数±标准差表示,通过方差分析进行检验,以P<0.05为差异具有统计学意义的标准。结果1.PCB 20与PCB 22等化合物诱发L-02微核的效应以及人CYP2E1抑制剂的影响PCB 20和PCB 22都在10μmol/L以上浓度引起一定的细胞毒性,但细胞生存率均高于70%。在加入了DCE(1000nmol/L)后,细胞毒性略有减弱。PCB 20与PCB 22均诱发L-02细胞微核形成,且呈明显的浓度-效应关系。而DCE共培养可阻断两种PCBs诱发微核的效应。DMSO可抑制PCB 22诱发L-02细胞微核的作用,表现为1.6‰(v:v)浓度时呈现完全抑制(印证DMSO抑制人CYP2E1活性)；而DMSO保持2‰(v:v)时,B(a)P和AFB1却仍然诱导L-02细胞微核形成并呈现明显的浓度-效应关系,提示PCBs对L-02细胞的遗传毒效应主要依赖于人CYP2E1的活性,而另外几个CYPs亚型没有明显的作用。2.稳定表达人CYP1A1的V79细胞系的构建与PCB 52,74,77及81对V79-hCYP2E1和V79-hCYP1A1诱发微核的作用。与V79对照细胞不同,经过转染(含人CYP1A1的cDNA的)真核表达载体的细胞能够在含博来霉素(300 mg/L)的选择性培养液生长并形成集落(集落形成率为25.3％)。对单克隆化的抗生素抵抗细胞进行的蛋白免疫印迹试验,观察到其具有人CYP1A1蛋白表达,而未转染的V79细胞则无表达。并且CYP1A1依赖性间接致突变物苯并(a)芘(10μmol/L)对转染细胞诱发微核形成,而对V79对照细胞则无作用。结合蛋白表达和CYP1A1酶依赖性遗传毒效应,可判断已成功构建V79-hCYP1A1细胞。各受试PCBs对V79-hCYP1A1细胞的微核试验显示,PCB 74,77以及81仅能在40 μmol/L(最高测试浓度)诱发微核细胞率升高,而PCB 52则无作用。在V79-hCYP2E1细胞,PCB 52,74,81均能诱发微核细胞率增高；其中PCB 74和PCB 81于20pmol/L即能明显诱导V79-hCYP2E1细胞微核形成。PCB 77对V79-hCYP2E1细胞无明显作用。3.苯及其羟化代谢物诱导V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞毒性作用苯、苯酚在受试浓度(10～300 μmol/L)未显示细胞毒性；1,2,4-三羟基苯于320μmol/L浓度明显降低细胞存活／生长水平；氢醌、儿茶酚以及苯醌均在20pmol/L出现了细胞存活率降低。CYP酶抑制剂ABT (60pmol/L)可抑制氢醌的细胞毒性,表现为氢醌在20 μmol/L浓度的细胞毒性阻断。ABT对儿茶酚的细胞毒性的抑制作用更加明显,表现为ABT增加各儿茶酚浓度组细胞存活率。这些结果以细胞毒作用为试验终点提示人CYP2E1可继续活化氢醌和儿茶酚为细胞毒性更强的代谢物。4.1-甲基芘与1-羟甲基芘诱导V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞毒性作用1-甲基芘于微核试验相应的暴露条件下,对V79细胞与V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞都未显示明显的细胞毒性；然而在5 μmol/L浓度对两种细胞均呈现低剂量兴奋效应(hormesis,即细胞生长增强),而且在V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞该作用不受任一酶抑制剂共培养的影响,提示这个低剂量兴奋效应不依赖于代谢活化。1-羟甲基芘在则在基因突变试验的暴露条件下,于0.5μmol/L和1 μmol/L浓度时对V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞(而非V79细胞)产生低剂量兴奋效应,且该效应可由PCP阻断,提示这样的低剂量兴奋效应是由终毒物引起。这两种情况下低剂量兴奋效应的差异尚有待进一步研究作解释。综合所观察到的结果,1-MP和1-HMP用于微核试验及基因突变试验的浓度建议为2-20μmol/L和0.5-4μmol/L。结论1.PCB 20与PCB 22能够在内源性表达的CYP2E1作用下诱发微核。人CYP1A1、人CYP1A2、人CYP1B1与人CYP3A4对于这两种PCBs的代谢活化无明显作用。本研究首次在人类细胞中观察到多氯联苯诱发染色体改变的作用。2.人CYP2E1主要参与NDL-PCBs的活化,对四氯联苯中的DL-PCBs仅有轻微活化作用；人CYP1A1对PCBs代谢活化的能力远低于人CYP2E1对PCBs的作用。3.人CYP2E1不仅能够羟化苯,还能(在不依赖髓过氧化物酶条件下)继续活化苯的多羟基代谢物为细胞毒性更强的活性代谢物。4.1-MP与1-HMP在不同条件下均可对哺乳动物细胞表现低剂量兴奋效应,但只有后者依赖于代谢活化。