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在农业生产中,植物常常会受到各种不良环境的影响,其中低温是严重影响作物生长的环境胁迫因子,CBF基因在植物应答低温胁迫中起着关键的作用,本实验室从茶树中克隆并鉴定了一个CsCBF2基因,构建植物表达载体并转化烟草,本研究对过表达CsCBF2的转基因烟草对非生物胁迫的耐受性进行了研究,主要研究内容及结果如下:1.通过PCR、RT-PCR和western blot分析,筛选到稳定表达CsCBF2的T2代纯合转基因植株,用于后续其对低温、高盐和脱水胁迫下的耐受性的研究。2.对转基因烟草进行高盐、脱水和低温等非生物胁迫处理,通过测量发芽率、根长、鲜重、存活率以及电解质外渗率变化等生理指标来研究转基因烟草的抗逆性。在高盐和脱水胁迫下,转基因烟草发芽时间早,发芽率高于野生型烟草;在高盐胁迫下,转基因烟草的根长长度和鲜重较野生型烟草分别提高了62.33%和52.21%;在脱水胁迫下,转基因烟草的根长长度和鲜重较野生型烟草分别提高了30.49%和42.49%;在低温胁迫下,转基因烟草的根长长度和鲜重较野生型烟草分别提高了77.32%和61.85%。进一步对低温处理下的转基因烟草进行分析,发现在低温处理后转基因烟草的存活率较野生型烟草提高了1.65倍,电解质外渗较野生型烟草低了28.23%,说明转基因烟草细胞膜破埙程度低于野生型烟草,表现出抗寒性;同时转基因烟草的可溶性糖和脯氨酸含量较野生型烟草分别增了1.01倍和0.31倍,表明可溶性糖和脯氨酸含量的增加提高了转基因烟草的抗寒性。综合以上分析表明在非生物胁迫下,转基因烟草表现出极显著抗逆性。3.对野生型和CBF2过表达转基因烟草(L5,L17)进行转录组测序,对高质量有效的reads合并拼接,最终获得299,333个烟草转录本,Unigenes 203,218个。使用BLAST软件将Unigenes分别与SwissProt,Nr,Nt,KEGG,interproscan,KOG,GO七大公共数据库进行比对,分别比对上45,428(22.35%)、79,981(39.36%)、150,753(74.18%)、39,584(19.48%)、112,787(55.50%)、32,342(15.91%)、14,498(7.13%)条,获得Unigenes的注释信息,为信号网络的分析提供数据。4.采用DESeq R程序筛选野生型和转基因型烟草间的差异基因,结果显示,在WT vs L5中,差异表达基因有2613个,其中上调基因1654,下调基因959;在WT vs L17中差异表达基因有2545个,上调1762个,下调783个,在(WT vs L5)vs(WT vs L17)中,共得到交集的763个差异基因。通过表达数据分析发现L5与L17转基因组间的基因表达模式极为相似,而转基因和野生型间的基因表达模式差异较大。5.在763个差异基因中,鉴定出ERF转录因子有33个,其中上调32个,下调1个,ERF转录因子在调控乙烯信号通路中起着重要的作用;22个WRK转录因子全部上调的;MYB转录因子10个,其中上调8个,下调2个;DREB转录因子6个全部上调;NAC 6个也全部上调。这些转录因子的改变可能提高了转基因烟草的抗逆性。6.对差异表达基因进行GO富集分析,结果显示在生物过程中的代谢过程、细胞过程、细胞代谢过程明显富集;在细胞组分中细胞部分、细胞和细胞膜部分显著性富集;在分子功能中酶催化活性、蛋白结合、转录调节因子活性等发生富集。进一步KEGG通路富集结果显示,代谢通路、信号转导通路、不饱和脂肪酸生物合成通路、氨基酸合成通路等显著性富集。7.结合生理生化分析及转录组分析推测茶树CsCBF2通过调控乙烯途径、信号转导途径、不饱和脂肪酸的合成代谢途径以及防卫基因诱导和细胞壁修复等相关基因的表达来调节植物的抗逆性。