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聚羟基烷酸脂(PHA)是一类生物可降解塑料,具有许多优良特性和很好的应用前景,近年来在医学领域和材料工程中发展很快。目前,PHA的生产主要是微生物发酵法,研究方向主要围绕新型PHA的合成、PHA生产成本的降低等方面。本实验研究的是聚羟基丁酸(PHB)。
为了提高PHB产量,降低生产成本,本室利用透明颤菌血红蛋白(vhb)与氧结合的能力构建能在高密度发酵过程中维持高溶氧的产PHB工程菌株,将编码VHb蛋白的基因在质粒上高拷贝表达和整合到染色体上(低拷贝表达)都没有达到预期效果,本实验构建VHb蛋白重组表达载体,将vhb结构基因置于tac启动子后,使VHb蛋白在IPTG的诱导表达下,构建E.coliHMS174(pDK101V)。摇瓶培养时发现,在菌体对数生长后期加入IPTG对菌体的生长影响最大,当在23h加入诱导剂时,E.coliHMS174(pDK101V)最终菌体浓度OD600达到32.4,PHB含量达到78.4%,而对照菌株E.coliHMS174(pDK101V)在不加诱导剂的情况下,最终菌体浓度OD600达到21.6,PHB含量达到70.8%。在5L发酵罐中培养时,在对数生长后期诱导VHb蛋白表达,最终工程菌菌体密度OD600达到96.4,PHB含量达到了50.2%;E.coliHMS174(pDK101V)在不加诱导剂的情况下菌体密度OD600达到120.6,PHB含量达到62.4%。
本实验利用mini-Tn5转座子随机突变E.coliHMS174,在溴化钠-溴酸钠筛选平板上筛选产酸少的突变株,通过摇瓶实验获得突变菌株E.coliT13,将含有phb操纵元和维持质粒稳定的parDE基因的质粒pTZ101转化E.coliT13,构建工程菌株E.coliT13(pTZ101),通过发酵罐培养发现,突变株乙酸产量降低,最终菌体密度OD600达到78.6,PHB含量为52.4%,对照菌株E.coliHMS174(pTZ101)菌体密度OD600达到98.4,PHB含量达到55.8%,而突变株的产乙酸的量是对照菌株的50%,对照菌株的磷酸转乙酰酶的活性比突变株的高82.8%。