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研究背景:昆虫的生长发育是通过定期的蜕皮实现的,蜕皮过程是在甾醇、保幼激素、20-羟基蜕皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)等几种昆虫激素的调节下完成的。20E的受体是种核受体,由蜕皮激素受体(ecdysone receptor,EcR)及超螺旋蛋白(ultraspiracle protein,USP)组成,在20E的诱导下EcR与USP结合形成二聚体时,只有EcR/USP二聚体才能与位于蜕皮激素可诱导基因启动子区的蜕皮激素响应元件(ecdysone response element,EcRE)相结合而启动早期基因的转录。如果这种激素依赖性的生化代谢的任何步骤受到干扰,都可能导致靶昆虫的死亡或生长发育异常。目前,已有20多种昆虫的EcR和(或)USP被克隆,其中EcR具有种类和种群的特异性,而EcRE的结构则以黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)的小分子热休克蛋白基因启动子(Hsp27-promoter)最为典型。目前第一、二代杀虫剂环境危害性弊端突显,而昆虫抗药性则是第三代杀虫剂面临的主要问题,开发多种杀虫剂循环,联合使用则是减少害虫抗药性产生的首要途径,所以建立能够高效筛选新型杀虫剂的高通量筛选模型迫在眉睫,Hien TT等在酵母中建立了一个针对云杉色卷蛾(Choristoneura fumiferana,Cf)EcR的配体调节转录激活(transactivation)系统,应用果蝇Hsp27启动子序列上的响应元件EcRE(23bp),连接上CYC1(iso-1-cytochrome C)启动子,在CfEcR及CfUSP同时存在时,在没有配体存在的情况下,EcR与USP也可自发形成二聚体使报告基因强烈表达。因而我们可以在酵母体内组成型表达卫生害虫的EcR及USP,用EcR/USP二聚体启动果蝇EcRE-Hsp27启动子,使得昆虫蜕皮调节通路关键调节阶段在酵母中重现,并且在启动子后连接绿色荧光蛋GFP报告基因,利用这个模型来筛选作用于调节通路的药物,进而开发出活性高、专一性强、对人畜安全、在生物体内易降解的新型生物杀虫剂。目的:建立卫生害虫蜕皮激素类似物杀虫剂筛选模型,通过此构建的酵母模型筛选昆虫蜕皮激素受体结合调节剂,然后利用筛出的药物作用于卫生害虫,进而开发出活性高、专一性强、对人畜安全、在生物体内易降解的新型生物杀虫剂。方法:人工合成白纹伊蚊(Aedes albopictus)EcR和USP的编码序列,两个基因以双表达盒形式亚克隆入表达质粒pGAP-Z,并整合到毕赤酵母(Pichia pastoris)的染色体上使EcR与USP在酵母中组成型表达,构建成酵母A。人工合成果蝇EcRE,从果蝇基因组DNA中扩出Hsp27-promoter序列,再接上绿色荧光蛋白(Green fluorescence protein,GFP)报告基因,将EcRE-Hsp27promoter-GFP片段亚克隆入pPIC3.5k,并整合到毕赤酵母A染色体的另一位点上(pGAP-Z与pPIC3.5k与毕赤酵母染色体的整合位点不同),从而构建成酵母模型(酵母B),通过施加蜕皮激素类似物二芳酰肼类农药虫酰肼验证酵母模型的敏感性,并初步使用酵母模型筛选一部分放线菌分泌物。结果:成功的构建了酵母表达质粒pGAP-Z-TEF-USP-CYC-EcR、pPIC3.5K-ECRE-Hsp-GFP,转化后的酵母模型在荧光显微镜下可见绿色荧光,证明EcR、USP在酵母中成功表达,两者结合形成的EcR/USP二聚体作用于EcRE启动报告基因表达荧光蛋白。施加药物虫酰肼后模型酵母荧光强亮度远低于未加药物的对照组模型酵母,表明GFP的表达受到抑制。半定量RT-PCR证实在虫酰肼作用下酵母模型内GFP基因的转录水平低于对照组。利用酵母模型筛选放线菌分泌物,发现一株放线菌分泌物可以影响酵母生长。结论:首次构建了以GFP为报告基因的卫生害虫蜕皮激素类似物杀虫剂酵母筛选模型。