转Bt基因抗虫棉的商业化种植,有效地控制了棉铃虫等靶标目害虫的危害,具有重大的生态、经济和社会效益。目前,我国种植的为表达Cry1Ac蛋白的Bt棉,虽然可以有效防治以棉铃虫、红铃虫为代表的主要靶标害虫,但对斜纹夜蛾等次要害虫的毒杀效果一般。为了更好的持续使用Bt棉,扩大Bt棉的杀虫谱,开发筛选新型Bt蛋白具有重要意义。通过生物测定实验发现,我们发现,相比Cry1Ac蛋白,具有我国自主知识产权的Cry1Ca7蛋白对斜纹夜蛾、甜菜夜蛾具有优异的毒杀效果,我们进一步研究了Cry1Ca蛋白对斜纹夜蛾的杀虫机制,研究结果将为我们未来更好的利用Cry1Ca蛋白奠定基础。主要实验结果如下:1.测定了Cry1Ca、Cry2Ab、Cry2Ah、及Vip3Aa四种Bt蛋白对斜纹夜蛾、棉铃虫、玉米螟、甜菜夜蛾、黏虫、二化螟的杀虫效果。结果表明,Cry1Ca对斜纹夜蛾有明显的毒杀效果,对甜菜夜蛾、二化螟也有较好的杀虫作用,但对玉米螟杀虫效果较差,对黏虫没有杀虫效果。2.利用透射电子显微镜观察了取食含Cry1Ca蛋白不同时间后斜纹夜蛾中肠组织超微结构的变化。结果表明对照组斜纹夜蛾中肠的柱状细胞和杯状细胞均排列整齐有序,修长且密集,细胞核成圆形或椭圆形,核膜清晰,染色质分布均匀,线粒体为椭圆形,内脊清晰可见,内质网呈线状整齐排布于细胞质中。而取食含Cry1Ca蛋白的饲料后,柱状细胞和杯状细胞微绒毛发生肿胀、扭曲,细胞核形状拉长或畸形,无明显的核膜并且染色质分布不均匀,线粒体变形,发生空泡化,內脊模糊不清,内质网变得杂乱无章、肿胀变形、数量也变少,且随着取食时间的加长病变加重。3.利用pull-down的方法寻找斜纹夜蛾结合Cry1Ca的特异性蛋白,先将Cry1Ca蛋白与填料结合,再使斜纹夜蛾BBMV流经上述填料,洗去非特异性结合蛋白与杂质,SDS-PAGE检测特异性结合蛋白,并送往公司做质谱分析,最终确定与Cry1Ca蛋白特异性结合的斜纹夜蛾BBMV上的蛋白类型。结果表明Cry1Ca可以与斜纹夜蛾中肠上APN、Actin、Polycalin、ABCC2等多种蛋白结合。4.我们进一步对ABCC2基因的表达谱、结合特性及功能进行了研究。利用荧光定量PCR检测ABCC2在斜纹夜蛾不同组织和不同龄期的表达量差异,发现ABCC2随着斜纹夜蛾幼虫的龄期增加,其相对表达量也随之增加,在中肠和马氏管中的表达量显著高于其他组织,这符合ABCC2参与代谢和转运功能的报道。对ABCC2膜外片段进行原核表达,并提取纯化(47kDa左右),Ligand blot试验结果表明Cry1Ca可以与ABCC2片段特异性结合。构建pAc5.1B-EGFP-ABCC2质粒并转染Sf9细胞中,进行细胞生测试验,结果表明转入ABCC2基因后端Sf9细胞对Cry1Ca和Cry1Ac的敏感性均显著上升(P<0.05)。本研究明确了Cry1Ca对棉田次要害虫斜纹夜蛾的毒杀效果,并确定了斜纹夜蛾Cry1Ca部分受体蛋白,以及相关功能验证,为防治斜纹夜蛾和更好地应用转基因抗虫棉提供理论基础。