论文部分内容阅读
本实验主要是对一个水稻隐性突变体及其对应的基因进行各方面比较系统的研究。该突变体表现为:抽穗期最上节间剧烈伸长,达对照的两倍;穗颈大大伸长,穗子增长,比对照增加12%,茎秆变高。具体得到的实验结果如下: (1) 用常规杂交方法,用307T(具eui突变体性状,来自于粳稻eui stock)和珍汕97(野生型EuiEui)这一对近等基因系进行杂交,分两次构建了一个总数达到6000多株的F2群体以进行Eui基因的图位克隆。 (2) 利用最新公布的水稻籼粳稻基因组序列:日本晴(粳稻)(http://140.109.57.19/aspgc/sequencing.php)和9311(籼稻):(http://btn.genomics.org cn/rice/),在第五染色体长臂端偏上部14.5cM的范围内设计了70多对引物以期得到307T和珍汕97之间的CAPS标记(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence,酶切片断多态性标记)。其中部分直接从公共数据库中获得,它们的多态性存在于日本晴(粳稻)和Kasalath(籼稻),经鉴定,其中大部分也存在于本实验中的近等基因系之间。而其他大部分是新设计的。有些引物的PCR产物在307T和珍汕97之间不存在着日本晴与9311之间的多态性,这种情况下,我们将PCR产物克隆到测序载体中并测序,寻找两亲本间的多态性。结果共鉴定出45个理想的CAPS标记,所用的内切酶总共26种。通过在其它籼粳稻之间的验证,发现这些标记大部分适用于其他籼粳稻亲本之间; (3) 利用198个F2隐性高杆和少量显性矮秆株组成的小群体和部分CAPS标记将目的基因粗略定位在第五染色体长臂端中部5cM范围内; (4) 用1500个F2隐性高杆和少量的显性矮秆组成的F2亚群体和13个新发展的CAPS标记最终构建了Eui基因区域的高密度遗传图谱和BAC重叠群,将目的基因定位在0.6cM的24kb大小的基因组DNA区域内; (5) 目标区域的DNA碱基序列通过运用GENESCAN等软件分析和预测可知,其中含有2个ORF,在水稻全长cDNA(ES7)数据库查找后,证实此2个ORF确实是可表达的功能基因; (6) 测定并比较突变体和野生型个体目的基因区域碱基序列,发现若干个可能的导致基因突变的位点; (7) 功能互补试验:将含有上述所提到的DNA大片断的了AC表达载体(插入片断为40kb)转化突变体(包括eui stock和307T),结果有一批植株(T0和T1代)回复到野生型植株的性状; (8) 转基因植株的分子检测:PCR和Southern blotting均表明目的片断已整合到部分植株染色体基因组DNA中;对转基因植株后代的遗传与分离情况进行了分析,发现目的片断在大部分阳性植株后代中能够比较稳定地遗传下去,但在这些后代(包括T1和T2代)中,高(euz’--)矮(加j一)植株似乎没有按照孟德尔遗传分离规律分离;(9)测定野生型和突变株上节间内源油菜素内酷(BRS)和赤霉素(GAs)类物质的含量,结果显示BR含量在两种植株上节间没有显著的差异;而突变株上节间内有生物活性的GA类物质如GAI的含量非常高,表明euz’性状很可能是由GA含量异常升高引起的;(10)在苗期用不同浓度的GA处理3O7T和308D,发现307T对外施GA有更高的敏感性;(11)细胞生物学分析:将3O7T和珍汕97同时播种,在它们抽穗一周后,分别取它们的茎杆最上节间部分,制作石蜡切片,包括纵切和横切方向。切片观察分析发现两种植株间对应部位的细胞形态有一定的差异:茎节基部(分生组织)细胞有一定的差异,在307中该区域仍有部分分生组织细胞。显著的差异是307T伸长区细胞比308D对应区域细胞要长近一倍;