动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)及其引起的临床后果,如冠心病,已经成为当今社会威胁人类健康的头号杀手。目前越来越多的证据认为动脉硬化发生的主要原因是多种危险因素造成的内皮损伤和内皮自我修复功能之间的失衡。过去的观点认为,损伤的内皮主要由邻近内皮细胞迁移和增殖修复,但最近研究发现,骨髓来源的内皮祖细胞(EPCs)是一群有增殖和分化为成熟内皮细胞潜力的细胞,承担着修复血管的重任。研究发现,多种致动脉粥样硬化危险因素(如高胆固醇血症,高血压,高胱氨酸血症,高糖等)都可使EPCs数目及功能显著降低,提示EPCs在AS的发生和发展中起了重要作用。以胰岛素抵抗(IR)及高胰岛素血症为特征的疾病如糖尿病,肥胖,糖耐量下降,脂代谢紊乱等均为心血管系统功能失衡的重要组成部分,通过引起内皮功能紊乱,从而导致高血压,动脉粥样硬化及冠状动脉疾病。IR可通过不同机制导致内皮功能紊乱。2型糖尿病、代谢综合症及胰岛素抵抗的健康志愿者EPCs的数量及功能均下降,推测IR对EPCs具有抑制作用,但IR对EPCs的直接作用尚不清楚。本研究首先在体外以高浓度胰岛素为干预因素,观察对人脐血培养获得内皮祖细胞内皮型一氧化氮合酶(eNOS)表达的影响。其次,通过比较临床拟诊为稳定型心绞痛的非糖尿病患者中存在胰岛素抵抗者与非胰岛素抵抗者EPCs数量及功能差异,探索特定人群中IR对EPCs的影响。最后,通过研究临床拟诊为稳定型心绞痛的非糖尿病患者中胰岛素抵抗程度与冠状动脉病变程度的关系,探索IR在冠心病发展中的作用。本研究从细胞水平和临床流行病学等角度研究EPCs在IR状态下的变化及其在AS发病机制中的作用,全文由三个部分组成。第一部分高浓度胰岛素对体外培养内皮祖细胞eNoS表达的影响目的:高胰岛素血症是胰岛素抵抗的一种代偿表现或治疗后表现,许多研究证实高胰岛素血症是动脉粥样硬化(AS)的一个独立危险因素,但高胰岛素血症引起AS的机制还不明确。骨髓来源的内皮祖细胞(EPCs)是一群有增殖,分化为成熟内皮细胞潜力的细胞,参与血管损伤修复。本文旨在通过体外试验研究高浓度胰岛素对人EPCs内皮型一氧化氮合酶(eNOS)表达的影响探讨高胰岛素血症引起AS的作用机制。方法:采用密度梯度离心法自脐血(约80-90ml/袋)中分离单个核细胞(约10~6-10~7),于血管内皮生长因子(VEGF)刺激下培养至第7天,EPCs形成典型集落,并且经Dil-acLDL(Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白)鉴定为正在分化的EPCs。于各培养孔(细胞量约10~4-10~5/孔)分别加入终浓度为0,1nM、10nM、100nM、1000nM的胰岛素,干预24小时,采用Trizol试剂抽提细胞总RNA,行RT-PCR.检测eNOS mRNA表达。结果:eNOS表达自1nM开始增强,10nM时表达最强,100nM开始减弱,提示生理浓度胰岛素(1nM)对eNOS表达起促进作用,高于生理浓度10倍时(10nM)仍呈促进作用,高浓度胰岛素(＞10nM)有抑制作用。结论:在一定范围内,高于生理浓度的胰岛素对EPCs功能具有促进作用,但过高浓度的胰岛素对EPCs可产生抑制作用。提示随胰岛素抵抗加重,可能因高胰岛素导致的EPCs功能障碍而对动脉粥样硬化的形成产生不利影响。第二部分稳定型心绞痛伴胰岛素抵抗的患者循环内皮祖细胞数量及其功能的研究目的:以胰岛素抵抗为特征的疾病如糖尿病,肥胖,糖耐量下降,脂代谢紊乱等均为心血管系统功能失衡的重要组成部分,通过引起内皮功能紊乱,从而导致高血压,动脉粥样硬化及冠心病。近年研究认为冠状动脉病变的起因为内皮细胞损伤与修复机制失衡。内皮祖细胞(EPCs)来源于骨髓,可分化为成熟内皮细胞使内皮再生,参与内皮修复。本研究选取非糖尿病的稳定型心绞痛患者为研究对象,旨在观察胰岛素抵抗与内皮祖细胞数量及功能的关系。方法:选取临床拟诊为稳定型心绞痛行冠状动脉造影患者27例,男性19例,平均年龄58±7岁,检测空腹血胰岛素及血脂,血糖等生化指标,采用McAuley指数评价胰岛素抵抗程度,按McAuley指数＜5.8及McAuley指数≥5.8分为胰岛素抵抗组(共13例),非胰岛素抵抗组(共14例),采用冠状动脉病变积分评价冠状动脉病变程度。取外周血100μl行EPCs流式计数(标记CD133及VEGFR-2),外周血12ml经密度梯度离心获单个核细胞后行体外培养,7天后计数内皮祖细胞集落形成单位。结果:胰岛素抵抗组患者病变积分较非胰岛素抵抗组高(2.34±2.73比0.68±0.82.p＜0.05),血HDL-c水平较非胰岛素抵抗组低(1.08±0.17mmol/L比1.30±0.32mmol/L,p＜0.05)。胰岛素抵抗组内皮祖细胞数量(0.035±0.046%比0.116±0.112%,p＜0.05)及集落形成单位(54.9±28.9比75.2±20.7.p＜0.05)较非胰岛素抵抗组低。结论:胰岛素抵抗的稳定型心绞痛患者循环内皮祖细胞数量及功能均降低,其冠状动脉病变程度较严重,提示内皮祖细胞功能障碍可能为胰岛素抵抗致动脉粥样硬化机制之一。第三部分稳定型心绞痛患者中胰岛素抵抗与冠状动脉病变程度关系的研究目的:目前研究发现胰岛素抵抗可能引起内皮功能不良,从而促进动脉粥样硬化,胰岛素抵抗是冠心病的独立危险因素。本研究选取临床上拟诊为稳定型心绞痛合并胰岛素抵抗的非糖尿病患者为研究对象,旨在研究胰岛素抵抗程度与冠状动脉病变的关系。方法:选取拟诊为稳定型心绞痛入院行冠状动脉造影病例272例,男性199例,平均年龄59±8岁,除外糖尿病患者,测定空腹血胰岛素及血脂,血糖等生化指标,采用McAuley指数评价胰岛素抵抗程度(McAuley指数＜5.8为胰岛素抵抗,McAuley指数≥5.8为非胰岛素抵抗),根据冠状动脉病变积分评价冠状动脉病变程度。结果:入选病例中有胰岛素抵抗者85例(占31.25%),76例冠状动脉未见粥样硬化改变(占27.94%),78例冠状动脉有粥样斑块但狭窄程度＜50%(占28.68%),118例冠状动脉狭窄≥50%(占43.3%)。McAuley指数与冠状动脉病变积分呈负相关(R=-0.153,p＜0.05),空腹血胰岛素浓度与冠状动脉病变积分相关性无统计学意义(p＞0.05)。根据冠状动脉病变积分分组(按冠状动脉病变积分＜1.89,1.9-4.83,≥4.84分为3组),冠状动脉病变积分高组McAuley指数较低(p＜0.05)。空腹血胰岛素浓度在各组中的差异无统计学意义。结论:胰岛素抵抗程度与冠状动脉病变的严重程度呈正相关,空腹胰岛素浓度与冠状动脉病变程度不相关。