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枯草杆菌蛋白酶属于细胞外丝氨酸内肽酶。枯草杆菌蛋白酶存在于古细菌、真细菌、真核生物和病毒中,主要特征是存在保守的Asp,His和Ser催化三联体。枯草杆菌蛋白酶属于丝氨酸肽酶或蛋白酶第二大家族（S8家族）的S8A亚家族成员。枯草杆菌蛋白酶具有广泛的底物特异性,在中性和碱性pH下具有较高活性和稳定性,常被用作洗涤、制革、食品等行业的生物添加剂。枯草杆菌蛋白酶在过去几十年一直是酶制剂研究开发的热点。本论文首先化学合成嗜碱性芽孢杆菌PB92的碱性蛋白酶基因Bapb92克隆至pBE2R载体中并转化到Bacillus subtilis WB600中构建重组工程菌Bacillus subtilis WB600/pBE2R-Bapb92。重组枯草杆菌工程菌利用糊精1%,可溶性淀粉2%,酵母提取物1%,NaCl 0.5%,pH7.0培养基进行发酵表达,培养60小时后进行菌液分离。发酵上清液经70%硫酸铵沉淀、SephadexG-25脱盐和Sephadex75层析三个步骤,获得电泳纯的碱性蛋白酶,纯化倍数6.8倍,比活2200U/mg,产率39%,经12%SDS-PAGE和质谱检测目的蛋白分子量为26.7kDa。利用定点突变的技术,对碱性蛋白酶BAPB92基因序列的188位、239位和262位氨基酸残基进行基因定点突变,构建了四个突变体BAPB92（A188P）、BAPB92（V262I）、BAPB92（Q239R）和BAPB92（A188P/V262I）。四个突变体发酵液酶活力相对于野生型都有提高,BAPB92（A188P）酶活力提高了2.6倍;BAPB92（V262I）酶活力提高了1.2倍;BAPB92（Q239R）酶活力提高了2.5倍;BAPB92（A188P/V262I）酶活力提高了3.3倍。以酪蛋白作为底物,相比野生型BAPB92,BAPB92（A188P）、BAPB92（Q239R）和BAPB92（A188P/V262I）催化效率（Kcat/Km）分别提高了1.5倍、1.3倍和4.3倍,但BAPB92（V262I）催化效率降低至野生型的0.4倍。在60℃下进行的热稳定性测定揭示,当保温1h时BAPB92残余酶活力为29%,BAPB92（A188P）残余酶活力为41%,BAPB92（V262I）残余酶活力为48%,BAPB92（Q239R）残余酶活力为35%,BAPB92（A188P/V262I）残余酶活力为51%,相比野生酶,突变体蛋白酶热稳定性均得到提高。在pH6-12范围内25℃下对BAPB92及突变体孵育2h,比较野生型和突变型的pH稳定性,揭示单一突变188位、239位氨基酸和组合突变A188P/V262I更能耐受碱性环境,单一突变262位氨基酸与野生型BAPB92耐碱情况相同。STPP（三聚磷酸钠）和MGDA（甲基甘氨酸二乙酸）是常用的洗涤剂螯合剂,突变体和野生型在分别含有二者的标准洗涤剂25℃孵育1h,与对照相比,BAPB92及其突变体都可在STPP和MGDA体系中能稳定存在,保持较高酶活性。通过比较常见的发酵培养基对重组枯草芽孢杆菌产碱性蛋白酶的影响,确定糊精1%,可溶性淀粉2%,酵母提取物1%,NaCl 0.5%,pH7.0为基础发酵培养基,在此基础上,经过单因素实验和正交实验确定发酵的最佳条件为:糊精5%、花生饼粉3%、酵母提取物1%、MgSO4 0.28%、NaCl 0.5%,起始pH7.0、装液量12%、接种量4%,此条件下37℃,200rpm培养60h。BAPB92使用优化后的培养条件下的酶活力相对于初始条件培养酶活力增长了4.9倍,BAPB92（V262I）增长了3.1倍,BAPB92（Q239R）酶活力增长了8.4倍,BAPB92（A188P）增长了10.6倍,BAPB92（A188P/V262I）酶活力可达到3111.94±37.25 U/mL,增长了11.2倍,酶活力得到显著提高。这些结果对枯草杆菌蛋白酶的生产及应用提供借鉴。