左旋门冬酰胺酶(L-ASP)是一种白色或微黄色冻干粉未,无嗅、无味,由4个亚基组成的同型四聚体,其相对分子量为133000±5000,主要作用是把血清中的门冬酰胺水解为门冬氨酸和氨,临床上主要用于治疗急性淋巴细胞性白血病(简称急淋)。急性白血病等肿瘤细胞会因既不能从血中取得足够门冬酰胺,亦不能自身合成,使其蛋白质合成受障碍,增殖受抑制,细胞大量破坏而不能生长、存活;正常细胞有自身合成门冬酰胺的功能而不受影响。本品亦能干扰细胞DNA、RNA的合成,可能作用于细胞G1增殖周期中。在临床应用上,重组L-ASP与其它的重组制品一样具有半衰期短、有较强的免疫原性、毒副作用大等缺点。由于体内半衰期较短,需要每天注射才能维持有效的血药浓度。结果长期而频繁的注射,增加了治疗成本,给患者带来严重的痛苦和不便,降低了依从性,加重了病人的经济负担。为了克服L-ASP在临床用药上的限制,本课题选择单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)对左旋门冬酰胺酶(L-ASP)进行N-末端定位修饰,通过增大其分子量,降低肾脏消除率,提高药物体内半衰期;偶联PEG的立体屏蔽效应,减缓了胰蛋白酶的降解,同时也使其免疫原性大大降低;由于PEG的生物相容性好、药物半衰期的延长,可以减少用药次数,也相应的降低了其毒副作用。本课题具体研究内容如下:一、通过对PEG修饰反应的主要影响因素摩尔比、反应温度、反应时间、反应pH值的筛选,建立了一种优化的PEG-L-ASP的制备及纯化工艺,其优化的修饰条件为L-ASP:mPEG=1:10,温度37℃,时间6h,pH=5.0,酶溶液浓度为5.0mg/ml,该优化条件下L-ASP的修饰转化率为87.94%;建立了离子交换色谱和凝胶过滤色谱联用的分离纯化工艺,并用其分离纯化了优化修饰条件下制备的PEG-L-ASP,得到了修饰产物均一、且纯度在95%以上的修饰酶。二、为了考察修饰产物PEG-L-ASP的理化性质及确证其一级结构,采用紫外扫描、IEF电泳、荧光胺法测修饰度、Western Blot免疫印迹、肽图分析等方法对偶联终产物PEG-L-ASP进行了分析。结果发现,纯化后的PEG-L-ASP的效价为134.076单位/mg,而L-ASP原酶的效价为373.670单位/mg,其修饰酶的活性保留为原酶的35.88%,修饰酶PEG-L-ASP与L-ASP原酶的最大吸收峰一样都在278nm的位置,等电点也都位于4.65～4.75之间,获得修饰酶PEG-L-ASP的PEG化率为3.27%,PEG-L-ASP修饰带与L-ASP未修饰带在Western Blot免疫印迹时都呈阳性反应,但PEG-L-ASP修饰带与抗体结合能力很弱,初步说明其免疫原性低,胰