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被子植物合子的第一次分裂是非对称性的，形成体积较小，细胞质浓厚的顶细胞和体积较大，高度液胞化的基细胞，基细胞经过横向分裂形成胚柄。顶细胞分裂形成的胚胎最终将发育成胚的顶端分生组织，子叶、胚轴、胚根和部分胚根尖分生组织。胚胎不同区域的发育分化及模式建成非常复杂，许多基因都参与这一发育过程。 由合子分裂而来的顶细胞和基细胞为什么会有如此悬殊的命运?两者的命运是如何决定的?又是什么时候决定的?通过突变体的研究，已经克隆鉴定了多个在植物胚胎发育过程中起关键作用的基因，认识到植物胚胎发育受多基因复杂调控。现已知道，基因表达的调节作用主要发生在转录水平，转录因子通过与靶基因启动子或增强子区域中的顺式作用元件结合和相互作用，成为调节靶基因转录效率的决定因素。目前已经鉴定的胚柄特异性基因有WOX8，WOX9，PtNIP1，G564等，并且有研究证明G564基因的上游区段一段10bp(即GAAAAGCGAA短序列)序列完全能够单独驱动胚柄中的转录表达。 本研究的目的是利用酵母单杂交技术鉴定与胚柄特异基因G564启动子的A区段(即GAAAAGCGAA短序列)相结合的调控因子。主要研究内容是构建了胚柄特异性顺式作用元件(5，-GAAAAGCGAA-3，)的诱饵载体 pHIS2.1-G564-5A(后称P5A)，并在不同营养缺陷型的培养基上进行验证；同时建立了拟南芥幼嫩种子的cDNA文库；并将诱饵载体 pHIS2.1-G564-5A、合成的拟南芥幼嫩种子双链cDNA以及线性pGADT7-Rec2载体DNA，共同转化到Y187酵母感受态细胞中，筛选阳性克隆进行分析。主要研究结果如下: 1.人工合成两条反向平行的寡聚5A核苷酸链(GAAAAGCGAA-GAAAAGCGAA-GAAAAGCGAA-GAAAAGCGAA-GAAAAGCGAA)，并将此DNA序列连接到pHIS2.1载体上，称P5A诱饵载体。对P5A进行了反向测序分析验证，测序结果说明与胚柄特异表达密切相关的核心序列(GAAAAGCGAA)区段的5个重复序列已经被构建到pHIS2.1载体上。将转化后诱饵载体的菌液稀释，分别涂在SD/-Trp；SD/-His/-Trp； SD/-His/-Trp/50mM3-AT琼脂平板上进行验证，结果说明诱饵载体P5A能够诱导筛选标记基因His的表达，但3-AT能够抑制His的表达，P5A可以作为诱饵载体进行下一步的酵母单杂。 2.拟南芥幼嫩种子总RNA的提取和cDNA文库的构建 1)本采用4种方法对拟南芥幼嫩种子的总RNA进行了提取和比较分析。3种方法所提取的总RNA均能满足一般的下游操作。Trizol法提取的RNA质量低。CTAB-异丙醇法提取的总RNA产量最高，并具有提取步骤少、操作时间短、价格便宜等优点，可用于大量样品提取；百泰克试剂盒提取时间短，可在常温下操作；CTAB-LiCl法提取的总RNA基本无基因组DNA的污染，但是不利于小分子RNA的沉淀。经紫外分光光度计检测，3种方法提取的总RNA OD260/OD280均在1.80～1.97，表明蛋白质及其它有机溶剂的污染很少，OD260/OD230在2.03～2.37，表明盐类小分子的污染也较少；电泳检测28S rRNA和18S rRNA条带清晰，28S rRNA的亮度基本为18S rRNA的2倍，所提取的总RNA质量较高。结果表明:利用CTAB-异丙醇法提取总RNA量大且完整性好，利用该方法提取总RNA，进而制备含有SMARTTMIII和CDSIII锚定末端的双链cDNA，ds cDNA清晰的分布在100 bp~5000 bp之间，可以进行下一步库的构建。 2)将含有SMARTTMIII和CDSIII锚定末端的双链cDNA20μl(2–5μg)，6μl Linear pGADT7-Rec2(3μg)和pHIS2.1-G564-5A(5μg)同时转化到酵母感受态细胞Y187中，将转化后的菌液稀释后涂在不同的营养缺陷型培养基上进行验证，结果表明诱饵载体P5A、蛋白表达载体pGADT7两个载体被同时转入到酵母Y187细胞中。 3.挑取第三次划线后SD/-Trp/-His/-Leu+100mM3-AT琼脂平板上的单克隆，进行质粒DNA的提取，并进行PCR验证，结果显示片段大小都在500bp至2000bp之间。将获得的目的片段进行切胶回收，连接到pMD-18载体上，转化到大肠杆菌DH5α中，检测阳性克隆并测序。