本论文的研究工作中引入介孔SBA-15等纳米粒子固定蛋白质,构建新型化学发光和荧光免疫探针。主要研究工作如下:1.提出了一种基于辣根过氧化物酶(HRP)和酶标抗体共同修饰的介孔SiO2纳米粒子(HRP-Ab2/SiO2)作为超灵敏免疫探针的制备新方法,并成功应用于人血清样品中甲胎蛋白(AFP)的灵敏检测。将AFP单抗固定在Au/SiO2介孔纳米粒子修饰的玻片,作为一抗,HRP-Ab2/SiO2探针作为二抗,基于夹心式免疫分析模式,检测AFP的含量。介孔SiO2由于具有较大的比表面积和交错的多维孔道,可以大大提高生物分子的的负载量,使得在每个微球上能够负载更多的HRP和AFP酶标二抗,使鲁米诺和H2O2的化学发光信号得到放大,拓宽了检测的线性范围。在优化的实验条件下,AFP在0.01 to 0.5 ng mL-1和0.5 to 100 ng mL-1二段范围内呈线性相关,检测限为0.005 ng mL-1 (3σ)。该免疫探针也可以应用于其他抗原或其他生物活性分子。2.将化学发光检测和流动注射技术相结合,基于药物释放原理,制备了一种基于底物鲁米诺释放的化学发光免疫探针,用于免标记免疫测定AFP的含量。采用氯硅烷来封闭介孔SiO2外壁的羟基活性基团,减少外壁对蛋白质或鲁米诺底物的化学吸附;对介孔SiO2基的内孔道则修饰羧基官能团,用于吸附大量的鲁米诺,并用于后期固定AFP单克隆抗体,制备免标记化学发光免疫探针。通过调节溶液的pH来调控鲁米诺的释放。当免疫反应结束后,形成的免疫复合物由于空间位阻的增大,会影响鲁米诺从孔道内部向溶液中的扩散,从而可以间接地定量溶液中抗原的含量。我们还对所制备的免疫探针进行了临床验证,表明该方法具有一定的准确性。3.提出了一种基于介孔磁性材料(Fe3O4/SBA-15)的二组分化学发光免疫传感系统,用于同时检测两种重要的肿瘤标志物:AFP和癌胚抗原(CEA)。采用具有较大的比表面积的介孔SiO2纳米粒子负载更多的单抗和辣根过氧化物酶(HRP)作为一抗,采用纳米金粒子负载抗原和Luminol底物分子来制备标记抗原,采用竞争免疫反应模式,来同时测定AFP和CEA的含量。加入待测抗原和标记抗原,当免疫反应结束后,通入H2O2,在固定化HRP的催化作用下,在两个检测通道里分别产生相对应于AFP和CEA二种抗原的化学发光信号,并在光门的辅助下分别检测两个通道中的信号。随着样品抗原浓度的增加,结合到流通池内的标记抗原的量就减少,化学发光信号也随之下降,AFP在浓度为1.0 - 100 ng mL?1范围内呈线性关系,而CEA在浓度为1.0 - 80 ng mL?1范围内呈线性关系,检测限为0.2 ng mL?1(3σ)。4.提出了一种基于异硫氰酸荧光素(FITC)标记荧光抗体修饰介孔SiO2的超灵敏标记探针,并成功用于检测人血清中甲胎蛋白(AFP)的含量。本方法通过EDC/NHS交联剂将FITC标记抗体固定在氨基功能化的介孔SBA-15上,制备得到抗体修饰介孔SBA-15的信号放大型荧光免疫探针(FITC-Ab*/ SBA-15)。将AFP单克隆抗体固定在纳米金/介孔SBA-15修饰的玻璃片上,然后植入流动注射体系,构建免疫检测流通池。基于夹心式免疫反应模式,结合流动注射分析技术,待测抗原与FITC-Ab*/SBA-15顺序注射到免疫流通池。免疫反应结束后,FITC-Ab*/SBA-15被引入到流通池的玻璃载体表面,进行荧光检测。介孔SBA-15纳米粒子由于具有较大的比表面积和交错的多维孔道,可以大大提高生物分子的的负载量,使得在每个微球上能够负载更多的FITC标记二抗,使荧光信号得到放大,拓宽了检测的线性范围。